УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный
санитарный
врач
Российской Федерации,
Первый
заместитель Министра
здравоохранения Российской
Федерации
Г.Г. Онищенко
24 июня 2003 г.
Дата
введения - 30 июня 2003 г.
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных
количеств дикамбы в зерне, соломе, зеленой массе растений, воде и почве
газожидкостной и тонкослойной хроматографией
Методические указания
1.
Вводная часть
Фирма-производитель:
«Гарда», Индия.
Торговое название: дикамба.
Название действующего
вещества по ISO: дикамба.
Название действующего
вещества по IUPAC: 3,6 - дихлор-о-анисовая кислота.
Структурная формула:
Эмпирическая формула: С8Н6С12О3.
Молекулярная масса: 221,05.
В чистом виде белые
кристаллы с Тпл, 114 - 116 °C. Упругость паров при 25 °C 4,5 · 10-3
Па (3,4 · 10-5 мм рт. ст.) Разлагается при 200 °C. Растворимость при
25 °C в воде 6,5 г/л, ацетоне 810 г/л, дихлорметане 260 г/л, диоксане 1,18 г/л,
этаноле 922 г/л. Растворимость в воде натриевой соли 360 г/л, калиевой соли -
480 г/л, диметиламинной соли 720 г/л по эквиваленту кислоты.
Коэффициент распределения n-октанол
- вода Log Kow 0,60 (при pH 5); -
0,80 (при pH 7); - 0,24 (при pH 9).
ПДК в воде 0,02 мг/л, ПДК в
почве 0,2 - 0,25 мг/кг.
МДУ в зерне хлебных злаков
«не допускается». Норматив «не допускается» установлен при нижнем пределе
методом ТСХ 0,3 - 0,5 мг/кг и методом ГЖХ 1,5 мг/кг см. в книге «Методы определения
микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде» /Под
ред. М.А. Клисенко, М.: Колос, 1997, с. 188 - 238.
МДУ в США в зерне - 0,5
мг/кг, в молоке - 0,05 мг/кг.
2.
Методика определения дикамбы в зерне, соломе, зеленой массе растений, воде и
почве
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Метод основан на извлечении
дикамбы из подкисленной пробы диэтиловым эфиром, очистке экстракта
перераспределением в водно-щелочную среду, а затем, после подкисления раствора,
в хлороформ с последующей доочисткой сублимацией в вакууме. Для зеленой массы
растений перед сублимацией проводится очистка активированным углем.
Определение дикамбы проводят
ГЖХ в виде метилового эфира или ТСХ.
2.1.2. Метрологическая характеристика метода
Метрологическая
характеристика метода представлена в табл. 1.
2.1.3. Избирательность метода
Таблица 1
Метрологическая
характеристика метода
|
Объект
|
Нижний предел определения, мг/кг
|
Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг
|
Среднее значение определения С, при n = 25, %
|
Стандартное отклонение, S при n = 25, ± %
|
Доверительный интервал среднего определения при n = 5, n =
0,95, %
|
Размах варьирования R, %
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
|
ГЖХ
|
|
Зерно (ячмень, овес, пшеница, рожь)
|
0,005
|
0,005 - 0,1
|
84,2
|
9,7
|
84,2 ± 13,5
|
72 - 110
|
|
Солома
|
0,02
|
0,02 - 0,4
|
81,8
|
10,2
|
81,8 ± 14,1
|
65,4 - 103
|
|
Зеленая масса
|
0,02
|
0,02 - 0,4
|
82,5
|
11,6
|
82,5 ± 16,1
|
60,4 - 112
|
|
Вода
|
0,0002
|
0,0002 - 0,004
|
75,6
|
12,8
|
75,6 ± 17,6
|
70,3 - 98,5
|
|
Почва
|
0,005
|
0,005 - 0,1
|
85,5
|
9,6
|
85,5 ± 13,4
|
73 - 100
|
|
ТСХ
|
|
Зерно (ячмень, овес, пшеница, рожь)
|
0,25
|
0,25 - 0,5
|
77
|
10
|
77 ± 14
|
60 - 100
|
|
Солома
|
1,0
|
1 - 5
|
79
|
13
|
79 ± 18
|
60 - 100
|
|
Зеленая масса
|
1,0
|
1 - 5
|
78
|
8
|
78 ± 11
|
70 - 90
|
|
Почва
|
0,25
|
0,25 - 0,5
|
78
|
9
|
78 ± 13
|
72 - 95
|
Метод селективен. Селективность метода обеспечивается сочетанием метода
ГЖХ с использованием двух альтернативных колонок, а ТСХ - двух альтернативных
систем подвижных растворителей.
2.2. Реактивы и материалы
Ацетон, хч, перегнанный над
КМnO4 и обезвоженный над Na2SO4 безводным
ГОСТ 2603-79
Гексан, хч,
свежеперегнанный ТУ
6-09-3375-78
Хлороформ, хч ГОСТ 20015-74
Диэтиловый
эфир, хч ГОСТ
6265-79
Кислота
ортофосфорная, Н3РO4, хч, 2 %-й раствор, по
объему ГОСТ 6552-80
Калия хлорид,
хч, 20 %-й раствор в 0,5 %-м растворе KOH ГОСТ 4161-77
Калия
гидроксид, хч, 0,5 %-й раствор ГОСТ
24363-80
Натрия
сульфат, хч, безводный ГОСТ
4166-76
Хроматон N-AW-DMCS с 5
% SE-30 (0,16 - 0,2 мм) или аналогичный носитель
Хроматон N-AW-DMCS с 5
% OV-17 (0,16 - 0,2 мм) или аналогичный носитель
Активированный
уголь, БАУ ТУ
6-09-3247-73
Кислота
серная, осч ГОСТ
14262-78
Серебро азотнокислое, AgNO3 ГОСТ
1277-75
Аммиак,
концентрированный ГОСТ 3760-79
Азот осч, из
баллона с редуктором ГОСТ
9293-74
Кислота
уксусная, ледяная, чда ГОСТ 61-75
Гидразин-гидрат,
чда ГОСТ
58322-65
Метиловый
спирт, хч ГОСТ 6995-77
Кальция
хлорид, хч ГОСТ
4460-77
Стеариновая или любая
твердая органическая кислота
Дикамба, с содержанием д.в.
не менее 95 %
Стандартный раствор дикамбы
в ацетоне с концентрацией 100 мкг/мл (раствор 1) и 1 мкг/мл (раствор 2)
2.3. Приборы, аппаратура и посуда
Газожидкостный хроматограф
Цвет 500 М или аналогичный с детектором «по захвату электронов»
Хроматографические колонки
длиной 170 см и 200 см, внутренним диаметром 3 мм
Камера
хроматографическая или аналогичная ГОСТ
25336-82
Ротационный
вакуумный испаритель ИР-1М ТУ
25-11-917-76
или
аналогичный с набором колб ГОСТ
25336-82
Прибор для микросублимации в
вакууме (рис. 1)
Прибор для получения
диазометана (рис. 2)
Кофейная мельница
Мерные колбы,
вместимостью 100 мл ГОСТ
1770-74
Пипетки с
делениями, на 5,1 мл ГОСТ
20292-74
Пульверизаторы
стеклянные ГОСТ
25336-82
Посуда лабораторная
стеклянная ГОСТ
25336-82
ГОСТ
1770-74
ГОСТ
9737-70
Градуированные пробирки с
пробками на шлифах, вместимостью 5 мл
ГОСТ
1770-74
Делительные
воронки, вместимостью 150 мл, 1000 мл ГОСТ
25336-82
Хроматографические пластинки
«Силуфол», Чехия
Хроматографические
пластинки «Сорбфил», 10´10 см ТУ 26-11-17-89
Баня водяная
или аналогичная ТУ
64-1-2850-76
Лампа
ртутно-кварцевая или аналогичная ТУ
16-535-280-74
Микрошприцы МШ-10, на 10 мкл
и МШ-100 на 100 мкл или аналогичные
Почвенное сито
Механический встряхиватель
2.4. Отбор проб
Отбор проб для анализа
проводят в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб
сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды
для определения микроколичеств пестицидов», утвержденными Минздравом СССР от
21.08.79 № 2051-79.
2.5. Подготовка к определению
2.5.1. Приготовление стандартных растворов
Для приготовления
стандартного раствора 1 с содержанием 100 мкг/мл в мерную колбу вместимостью
100 мл помещают навеску дикамбы (10 мг), взятую с точностью до ± 0,2 мг.
Навеску растворяют в ацетоне и доводят до метки тем же растворителем.
Для приготовления раствора 2
из раствора 1 пипеткой отбирают 1 мл и переносят в мерную колбу вместимостью
100 мл и доводят до метки ацетоном.
Стандартные растворы
стабильны при хранении в холодильнике в течение 6 месяцев.
2.5.2. Для ГЖХ определения
2.5.2.1. Приготовление диазометана.
В круглодонную колбу 1
вместимостью 100 мл, снабженную капельной воронкой с байпасом и обратным
холодильником, помещают 12 г (0,2 моля) KOH, 6 мл метилового спирта, 6
мл или 6,1 г (0,12 моля) гидразин-гидрата. Колбу охлаждают до +5 °C смесью
воды со льдом и начинают медленно, по каплям прибавлять из капельной воронки 10
мл (0,12 моля) хлороформа, постепенно увеличивая скорость. При этом реакционная
масса становится желтой.
Выделяющийся в ходе реакции
диазометан через обратный холодильник, соединенный с капилляром стеклянным
переходом, поступает в двугорлую колбу-приемник 2, вместимостью 100 мл,
содержащую 50 мл осушенного серного эфира. Колба 2 погружена в баню, содержащую
смесь воды со льдом.
По окончании прибавления
хлороформа реакционную колбу нагревают до 40 °C на водяной бане для полного
удаления диазометана из реакционной массы. После обесцвечивания реакционной
массы и стенок холодильника реакцию считают законченной. Диазометан хранят в
склянке с притертой пробкой в морозильной камере.
2.5.2.2. Подготовка газохроматографической колонки.
Для газохроматографического
анализа используют готовый товарный носитель хроматон N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм) с 5 % SE-30 и
хроматон N-AW-DMSC (0,16 - 0,20 мм) с 5 % OV-17.
Хроматографическую колонку заполняют насадкой с подсоединением слабого вакуума.
Достаточная плотность набивки обеспечивается равномерной загрузкой и
непрерывным постукиванием по колонке. Колонку кондиционируют при скорости азота
30 мл/мин в режиме программирования температуры от 50 до 220 °C со
скоростью нагрева 2 °C/мин, а затем в
изотермическом режиме при температуре 220 °C в течение 6 - 8 ч без
подсоединения колонки к детектору.
Общую подготовку прибора к
работе проводят согласно инструкции.
2.5.3. Для ТСХ измерения
2.5.3.1. Приготовление градуировочных растворов.
Градуировочные растворы
дикамбы в ацетоне с концентрацией от 10 до 60 мкг/мл готовят соответствующим
разбавлением стандартного раствора в пробирках с притертыми пробками
вместимостью 5 мл, согласно табл. 2.
Таблица
2
|
Номер
стандарта
|
Стандартный раствор (100 мкг/мл), мл
|
Добавлено ацетона, мл
|
Концентрация дикамбы, мкг/мл
|
Содержание дикамбы в 0,1 мл хроматографируемой пробы, мкг
|
|
1
|
0,5
|
4,5
|
10
|
1
|
|
2
|
1,0
|
4,0
|
20
|
2
|
|
3
|
1,5
|
3,5
|
30
|
3
|
|
4
|
2,0
|
3,0
|
40
|
4
|
|
5
|
2,5
|
2,5
|
50
|
5
|
|
6
|
3,0
|
2,0
|
60
|
6
|
Допустимый срок хранения градуировочных растворов при комнатной
температуре не более 10 дней.
2.5.3.2. Приготовление проявляющих растворов.
Проявляющий реагент.
Растворяют 0,5 г AgNO3 в 5 мл дистиллированной воды, добавляют 5 мл
концентрированного аммиака до растворения осадка и 90 мл ацетона. Хранить в
темном месте.
2.5.3.3. Приготовление хроматографической камеры
Хроматографическую камеру за
1 час до начала хроматографирования заливают смесью подвижных растворителей
хлороформ-ацетон (3:1) и хлороформ-уксусная кислота (20:1). Объем подвижных
растворителей в камере должен по высоте находиться не выше, чем на 0,7 - 1,0 см
от дна камеры.
2.6. Подготовка проб к анализу
Зерно размалывают на
кофейной мельнице до консистенции манной крупы. Отбирают навеску массой 20 г.
Солому и зеленую массу растений измельчают ножом или ножницами и отбирают
навески массой 5 г. Почву просеивают через почвенное сито отбирают навески
массой 20 г.
2.7. Проведение определения
2.7.1. Экстракция и очистка экстрактов
Зерно. Навеску анализируемой пробы
(20 г) помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, добавляют 2 %-й Н3РO4, тщательно увлажняют пробу.
Дикамбу экстрагируют этиловым эфиром трижды, порциями 100, 80 и 70 мл при
помощи механического встряхивания колбы в течение 30 и два раза по 15 мин.
Декантируют экстракт через складчатый бумажный фильтр в круглодонную колбу
вместимостью 500 мл. Дважды промывают остаток в колбе и фильтр диэтиловым
эфиром, порциями по 30 мл.
Объединенный экстракт
концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 30 - 40
мл. Остаток переносят в делительную воронку вместимостью 150 мл и несколько раз
ополаскивают колбу 20 %-м щелочным раствором KCl, общим объемом 20 мл.
Промывные воды также переносят в делительную воронку и проводят экстракцию
калиевой соли дикамбы путем встряхивания воронки в течение одной - двух минут.
После разделения слоев, нижнюю, водную фазу, сливают в другую делительную
воронку вместимостью 150 мл. Экстракцию повторяют еще один раз тем же
количеством раствора KCl.
Объединенный водный раствор
подкисляют серной кислотой, разбавленной водой (1:10), до pH 1 и
трижды экстрагируют дикамбу хлороформом, порциями один раз по 30 и два раза по
20 мл. Хлороформный экстракт порциями фильтруют через слой безводного сульфата
натрия в грушевидную колбочку вместимостью 50 мл. Каждую порцию фильтрата
концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 2 - 3 мл.
Фильтр со слоем сульфата натрия промывают 5 мл хлороформа. Последнюю порцию
сконцентрированного экстракта количественно, хлороформом, переносят в патрон
сублиматора. На горячей водяной бане из сублиматора полностью отгоняют растворитель,
регулируя равномерное распределение остатка по дну сублиматора. В патрон
помещают «палец» сублиматора, подсоединяют холодную воду и вакуум. Сублимацию
дикамбы проводят на кипящей водяной бане в течение 30 мин при давлении 0,2 мм
рт. ст. После окончания сублимации дикамбу смывают с «пальца» сублиматора в
грушевидную колбочку вместимостью 25 мл ацетоном, общим объемом 15 мл. С
помощью ротационного вакуумного испарителя из колбочки полностью отгоняют
растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 0,5 мл гексана, колбочку
закрывают пробкой на шлифе и стенки колбы ополаскивают растворителем. Далее
определение проводят методом ТСХ по п. 2.7.3.
При определении дикамбы
методом ГЖХ по п. 2.7.2 к сухому остатку пипеткой добавляют 2 мл
раствора диазометана в диэтиловом эфире. Через 10 - 15 мин диазометан и эфир
полностью отдувают слабым током воздуха. К сухому остатку пипеткой добавляют 4
мл гексана. Колбочку закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно
ополаскивают растворителем.
Солома, зеленая масса
растений. Навеску
анализируемой пробы массой 5 г помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл,
добавляют 10 мл 2 %-й Н3РO4, тщательно увлажняют пробу
и проводят экстракцию дикамбы и получение ее калиевой соли, как описано выше
для зерна. Водно-щелочной слой, содержащий калиевую соль дикамбы, трижды
промывают гексаном, порциями 2 раза по 20 мл и один раз по 10 мл. Гексановый
слой отбрасывают, а к водно-щелочному слою добавляют суспензию 0,5 г
активированного угля в 30 мл диэтилового эфира. Колбу интенсивно встряхивают, а
затем ее содержимое фильтруют через складчатый бумажный фильтр в делительную
воронку. Уголь на фильтре промывают 10 - 15 мл щелочного раствора KCl.
После разделения слоев, нижнюю, водную фракцию переносят в другую делительную
воронку, а эфирную фракцию отбрасывают. Водный раствор подкисляют до pH 1
разбавленной (1:10) серной кислотой и дальнейшее определение проводят так же, как
описано выше для зерна.
Вода. Пробу воды (500 мл) помещают
в делительную воронку вместимостью 1 л, добавляют 10 мл 2 %-й Н3РO4 и трижды экстрагируют
дикамбу из воды хлороформом, порциями по 50 мл. Хлороформные экстракты
объединяют в плоскодонной колбе вместимостью 250 мл, сушат над безводным
сульфатом натрия (~ 20 г) и порциями декантируют хлороформный раствор в
грушевидную колбочку вместимостью 50 мл. Каждую порцию раствора концентрируют с
помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 1 - 2 мл. Оставшийся в
колбе осушитель дважды промывают хлороформом, порциями по 10 мл. Каждую порцию
раствора декантируют в грушевидную колбочку и концентрируют. Из последней
порции раствора полностью отгоняют растворитель.
Метилирование дикамбы и
дальнейшие операции проводят по схеме, описанной выше для зерна.
Определение дикамбы в воде
проводят только методом ГЖХ.
Почва. Анализ почвы проводят так
же, как анализ зерна.
2.7.2. Определение газожидкостной хроматографией
Из 4 мл подготовленного по
п. 2.7.1
экстракта в хроматограф вводят 2 мкл.
Условия хроматографирования:
Колонка
1 Колонка 2
Насадка
колонки 5
% SE-30 на 5 % OV-17 на
хроматоне хроматоне
N-AW-DMCS N-AW-DMCS
(0,16 - 0,20
мм) (0,16 - 0,20 мм)
Длина
и внутренний диаметр колонки 170
см ´ 3 мм 200 см ´ 3 мм
Рабочая
шкала электрометра 64
· 10-10 мА 64 · 10-10мА
Скорость
протяжки ленты самописца, см/мин 0,25 0,25
Скорость
потока газа-носителя азота 30
мл/мин 25 мл/мин
Температура
термостата колонки, °C 180 200
Температура
испарителя, °C 200 220
Температура,
детектора, °C 230 300
Абсолютное
время удерживания 3
мин 57 с 4 мин 21с
Объем
вводимой пробы, мкл 2 2
Линейный
диапазон детектирования 0,05
- 1,0 нг 0,05 - 1,0 нг
Количественное определение
проводят методом соотношения со стандартом по высоте пиков.
Серию стандартов готовят
следующим образом: в 5 пробирок, вместимостью 5 мл, с пробками на шлифах,
пипеткой вносят из стандартного раствора 2 0,1; 0,2; 0,4; 1,0 и 2,0 мл, что соответствует
0,1; 0,2; 0,4; 1,0 и 2,0 мкг дикамбы. Из пробирок на горячей водяной бане или
слабым током воздуха полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой
одновременно с рабочей пробой добавляют по 2 мл раствора диазометана. Через 10
- 15 мин эфир и диазометан отдувают слабым током воздуха. К сухому остатку
пипеткой добавляют 4 мл гексана. Пробирку закрывают пробкой на шлифе и ее
стенки тщательно обмывают растворителем. Параллельно с рабочей пробой в
хроматограф вводят по 2 мкл полученных растворов. Расчет проводят по
стандартному раствору, высота пика которого наиболее близка к высоте пика
рабочей пробы.
2.7.3. Определение тонкослойной хроматографией
На пластинку силуфол или
сорбфил микрошприцем на 100 мкл или микропипеткой с оттянутым концом наносят
100 мкл (0,1 мл) полученного раствора. Справа и слева от рабочей пробы таким же
образом наносят серию стандартных растворов дикамбы (1, 2, 3, 4, 5, 6 мкг).
Необходимо следить, чтобы диаметр пятна наносимого раствора не превышал 0,5 см.
После высушивания пятен
пластинку помещают в хроматографическую камеру, в которую за 30 мин до начала
хроматографирования был налит подвижный растворитель. На пластинках силуфол
хроматограмму развивают в системе подвижных растворителей хлороформ-уксусная
кислота (40:1) или хлороформ-этилацетат-уксусная кислота (15:15:1); на
пластинках сорбфил - сначала в системе хлороформ-ацетон (3:1), а затем, после
высушивания хроматограммы, в системе хлороформ-уксусная кислота (20:1). После
развития хроматограмму высушивают на воздухе, а затем из пульверизатора сначала
обрабатывают проявляющим реагентом, а затем помещают под лампу УФ света на 3
мин. Дикамба проявляется на пластинке в виде коричневых пятен на светло-сером
фоне с Rf 0,25 ± 0,05. Линейный диапазон определения 1 - 6 мкг.
Пятна стабильны в течение одного часа, после чего фон темнеет.
2.8. Обработка результатов
анализа
2.8.1. При ГЖХ определении
Содержание дикамбы в
анализируемой пробе (X) в мг/кг, мг/л, вычисляют
по формуле:
где
Сст - количество стандарта,
введенного в хроматограф, нг;
Нрп - высота пика рабочей
пробы, мм;
Нст - высота пика стандарта,
мм;
V - общий объем рабочего раствора, мл;
Va - объем аликвоты,
вводимой в хроматограф, мкл;
P -
навеска анализируемого образца в г, или объем анализируемой воды в мл.
Если при введении в
хроматограф получаются слишком большие пики или происходит зашкаливание, к
рабочему раствору пипеткой добавляют замеренное количество гексана и анализируют более разбавленный
раствор.
2.8.2. При ТСХ определении
Количественное определение
дикамбы в пробе проводят путем сравнения площади и интенсивности окраски пятен
рабочей пробы и серии стандартов.
Содержание дикамбы в
анализируемой пробе (X) в мг/кг, мг/л вычисляют по
формуле:
где
С - количество дикамбы,
найденное в хроматографируемой пробе, мкг;
V - общий объем рабочего раствора, мл;
Va - объем аликвоты,
отобранный для хроматографирования, мл;
P -
навеска анализируемого образца в г или объем анализируемой воды в мл.
3.
Требования безопасности
Соблюдать требования
безопасности, принятые для работы с пестицидами, легковоспламеняющимися
жидкостями, в частности с диэтиловым эфиром.
Полное отсутствие открытого
огня в лаборатории!!!
Соблюдать «Правила
устройства, техники безопасности, производственной санитарии,
противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях,
отделениях, отделах санитарно-эпидемиологических учреждений системы МЗ СССР» №
2455-81 от 20.10.81, а также меры предосторожности при работе с ядовитым и взрывоопасным
диазометаном.
4.
Разработчики
Г.Ф. Вельская, К.Ф.
Новикова, Г.А. Козырева, ФГУП ВНИИХСЗР, г. Москва.
СОДЕРЖАНИЕ
