ГОСУДАРСТВЕННОЕ
САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ
НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГОСУДАРСТВЕННЫЕ
САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ
ПРАВИЛА И НОРМАТИВЫ
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения
концентрации клеток микроорганизма
Trichoderma longibrachiatum TW-1 - продуцента
b-глюканазы
в воздухе рабочей зоны
Методические указания
МУК 4.2.1070-01
Минздрав России
Москва 2002
1. Разработаны к. м. н. В. И.
Бобровым (ВНЦ по безопасности биологически активных веществ).
2. Утверждены и введены в
действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации -
Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября
2001 г.
3. Введены впервые.
СОДЕРЖАНИЕ
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный
санитарный врач Российской
Федерации - Первый
заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
20 сентября 2001 г.
МУК 4.2.1070-01
Дата
введения: с момента
утверждения
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Trichoderma longibrachiatum TW-1 -
продуцента b-глюканазы в воздухе
рабочей зоны
Настоящие методические указания
устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа
концентрации клеток штамма - Trichoderma longibrachiatum TW-1-продуцента b-глюканазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне
концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания
разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ
12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Методические указания
предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и
учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения
микробиологических исследований.
Продуцент b-глюканазы Trichoderma longibrachiatum TW-1 относится к классу несовершенных грибов. Рост характерных колоний
определяется на 5-6 сутки. На агаризованной среде СМ микроорганизм образует характерные
колонии до 15 мм в диаметре с гладкой подошвой, не врастающие в агар, с
волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами белого и
желтого цвета. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно ветвистые.
Оптимальная температура роста 28-30 °С.
Предельно допустимая
концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 5000 кл/м3, 3 класс
опасности, пометка А.
Методика обеспечивает
выполнение измерений количества клеток продуцента b-глюканазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне
концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной
вероятности 0,95.
Метод измерения концентрации
штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток (спор,
фрагментов мицелия) продуцента b-глюканазы на поверхность
плотной питательной среды СМ и подсчета выросших колоний по зонам просветления,
образующихся вокруг каждой колонии штамма как результат продукции b-глюканазы на среде с окрашенной целлюлозой.
При выполнении измерений
применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные
устройства, материалы
Прибор для
бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ
64-12791-77
Термостаты электрические
суховоздушные или водяные
Автоклав электрический ГОСТ
9586-75
Бокс, оборудованный
бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные,
аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с
иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с увеличением х 10 ГОСТ
25706-83
Чашки Петри
бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 100 мм
Пробирки биологические,
вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ
10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10
мл ГОСТ
10515-75
Пипетки мерные на 1,5, и 10
мл ГОСТ
1770-74
Колбы конические,
вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ
1770-74
Секундомер ГОСТ
9586-75
Барометр ГОСТ
24696-79
Марля медицинская ГОСТ
9412-77
Вата медицинская
гигроскопическая ГОСТ
25556-81
5.2. Реактивы, растворы
Бенгальский розовый
Диметилсульфоксид
Спирт этиловый ректификат ГОСТ
5962-67
Селективная среда для
штамма-продуцента b-глюканазы
Состав среды: КН2РO4- 1 г; MgSO4×7Н2O - 0,5 г; (NH4)2SO4 - 5 г; целлюлоза порошковая
в пересчете на сухое вещество - 5 г; глюкоза - 5 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г;
агар - 20 г;
вода дистиллированная - до
1000 мл.
При выполнении измерений
концентрации клеток продуцента b-глюканазы в воздухе рабочей
зоны соблюдают:
·
правила
техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ
12.1.005-88;
·
правила
электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ
12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;
·
требования,
изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике
безопасности в микробиологической промышленности» (1980);
·
положения
«Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе
в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической
промышленности» (1977).
Все виды работ с реактивами
проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с
биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными
лампами.
К выполнению измерений и обработке
их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием,
прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области
микробиологических исследований.
Процессы приготовления
растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при
температуре воздуха (20 ± 5) °С, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и
влажности воздуха не более 80 %.
9.1. Условия
отбора проб воздуха
Для определения продуцента b-глюканазы воздух аспирируют при помощи
аппарата Крогова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной
среды. Время аспирации воздуха (1- 10 мин) зависит от предполагаемой
концентрации клеток продуцента, а прямой метод позволяет учитывать на чашке до
200 колоний продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым
отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно
обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную
и внутреннюю стенку крышки.
На подвижный диск устанавливают
подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор
закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо.
После отбора пробы воздуха и
остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой
от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время
аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет
количества колоний, выросших на 2-3 сутки после посева проб воздуха по зонам
просветления, которые являются результатом образования целлюлаз на срезах с
окрашенной целлюлозой в присутствии повышенного количества глюкозы.
Существенным признаком
промышленных мутантов рода Trichoderma является пониженная
катаболическая репрессия по сравнению с дикими мутантами Trichoderma.
В то время как у диких штаммов глюкоза в концентрациях выше 0,02 г/л
практически полностью подавляет образование целлюлаз в глубинной культуре, у
промышленных мутантов подавление образования целлюлаз начинается при
концентрациях глюкозы выше 1 г/л.
Селективную среду
расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового,
растворенного в 1 мл диметил-сульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по
10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский
розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения
разрастания колоний на чашках. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на
сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные
чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха
чашки Петри помещают в термостат при 28-30 °С на 2 дня и затем при температуре
44 °С на 18 ч для образования вокруг колоний зон просветления.
Количественный учет
микробных клеток штамма-продуцента b-глюканазы проводится
методом подсчета зон просветления, образующихся вокруг колоний микроорганизма
как результат продукции глюканазы на среде СМ с окрашенной целлюлозой.
Расчет концентрации клеток
продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:
кл/м3, где
Х - концентрация клеток
продуцента в воздухе;
N - количество колоний
продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета
на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л
(произведение скорости на время аспирации).
Результаты измерений
оформляют протоколом по форме:
Протокол №
количественного
микробиологического анализа штамма-продуцента Trichoderma longibrachiatum TW-1 в воздухе рабочей зоны
Дата проведения
анализа
Место отбора
пробы
Название
лаборатории
Юридический
адрес организации
Результаты
микробиологического анализа
|
Шифр или № пробы
|
Определяемый
микроорганизм
|
Концентрация, кл/м3
|
|
|
|
|
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
1. ГОСТ
12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические
требования».
2. ГОСТ 8.563-96 «ГСИ. Методики
выполнения измерений».
3. Положение об организации
работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980,
27 с.).
4. Инструкции по устройству,
требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических
лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).
