4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение изолята соевого белка
в составе мясных продуктов

Методические указания
МУК 4.1.2881-11

Москва 2011

1. Разработаны НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян, В.К. Мазо, С.Н. Зорин, О.И. Козлова); ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии (А.Б. Лисицын, Ю.К. Юшина, А.Н. Иванкин, О.Е. Усанова); ООО «Стайлаб» (А.В. Галкин).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 № 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 27 июня 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

 

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение изолята соевого белка в составе мясных продуктов

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы определения содержания изолята белков сои (ИБС) в колбасных изделиях, мясных консервах на основе твердофазного непрямого (конкурентного) иммуноферментного анализа.

1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в установленном порядке.

2. Общие положения

2.1. ИБС, который добавляют в состав мясопродуктов в качестве связывающего вспомогательного вещества, является источником растительных белков.

2.2. Для определения ИБС в составе мясопродуктов был разработан метод непрямого (конкурентного) иммуноферментного анализа (далее - ИФА).

2.3. Разработанный метод позволяет определять ИБС при минимальной его концентрации 0,2 % по массе продукта.

2.4. Для целей настоящих методических указаний в документе использованы следующие сокращения:

PBS - фосфатно-солевой буфер;

ИБС - изолят белков сои;

ИФА - иммуноферментный анализ;

НЛС - нормальная лошадиная сыворотка;

НЛС-PBS - 0,5 %-й раствор НЛС в PBS.

3. Отбор и хранение анализируемых проб образцов

3.1. Отбор пищевых образцов для исследования осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 9792-73 «Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб»; ГОСТ 8756.0-70 «Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию».

3.2. Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками, маркируют и нумеруют. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб. В случае необходимости допускается хранить образцы при температуре (4 ± 2) °С в течение времени, не превышающего срока годности пищевых продуктов или замораживать при температуре - 10 - 12 °С и хранить не более 2 недель.

4. Принцип метода

Разработанный метод основан на конкуренции предварительно иммобилизованных на твёрдой поверхности (лунке полистирольной планшеты) антигенов и таких же антигенов, находящихся в растворе образца, за центры связывания специфичных к этим антигенам антител, вносимых в тот же раствор. В результате конкуренции количество антител, фиксируемых на твёрдой поверхности, оказывается в обратной зависимости по отношению к содержанию антигенов в растворе образца. После удаления раствора антител, связанных с определяемыми антигенами, добавляют раствор вторичных антивидовых антител, конъюгированных с пероксидазой. Вторичные антитела, оставшиеся в растворе, т.е. непрореагировавшие с антителами к соевому белку, удаляют. Затем добавляют в систему раствор хромогенного субстрата. Пероксидаза, конъюгированная со вторичными антителами, расщепляет хромогенный субстрат с образованием окрашенного продукта. При этом концентрация определяемого антигена, содержащегося в исследуемом образце, обратно пропорциональна концентрации продукта, образовавшегося в результате ферментативной реакции и регистрируемой оптической плотности раствора при длине волны, соответствующей максимуму поглощения продукта.

5. Средства измерений, материалы, реактивы

_____________

^(*) Допускается применение других средств измерений, оборудования и реактивов аналогичными техническими, метрологическими и качественными характеристиками.

6. Требования техники безопасности при проведении испытаний

При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

Помещение, в котором проводятся измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-91, и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019-79.

Все применяемые реактивы, за исключением о-фенилендиамина, в используемых концентрациях не токсичны. о-Фенилендиамин обладает канцерогенным действием. Поэтому в случае попадания вещества на кожные или слизистые покровы следует немедленно тщательно смыть его большим количеством воды. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Следует избегать контакта стоп-реагента с кожей.

Необходимо провести обучение работающих безопасности труда согласно ГОСТ 12.04.004.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению работы допускается обученный персонал со средним специальным или высшим образованием, прошедший в установленном порядке инструктаж, имеющий навыки практической работы в области химического и биохимического анализа и освоивший метод анализа.

8. Условия измерений

Измерения осуществляют в оборудованной для химического анализа лаборатории в условиях параметров окружающей среды, обозначенных в инструкциях по эксплуатации применяемого оборудования. Температура воздуха (20 ± 5) °С, атмосферное давление 84 - 106 кПа, относительная влажность воздуха не более 80 %.

9. Определение ИБС в колбасных изделиях

9.1. Подготовка проб

Отбор образцов для анализа ведется в соответствии с п. 3 данного документа. Образцы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодильнике без доступа света.

9.1.1. Подготовка реагентов для анализа

При исследовании образцов мясопродуктов для пробоподготовки необходимо приготовить следующие реагенты:

1) фосфатно-солевой буфер (PBS). Навеску (68,0 ± 0,2) г калия фосфорно-кислого 1-замещенного, взятую на лабораторных весах, переносят в мерную колбу на 500 см³, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Навеску (228 ± 0,2) г калия фосфорно-кислого 2-замещенного 3-водного, взятую на лабораторных весах, переносят в мерную колбу на 1000 см³, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Полученные растворы смешивают под контролем потенциометрического анализатора до достижения величины рН = 7,6 ± 0,05. Навеску (180 ± 0,2) г натрия хлористого переносят в мерную колбу на 1000 см³, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. В мерную колбу на 2000 см³ вносят мерным цилиндром 20 см³ смеси растворов фосфатов и 100 см³ раствора натрия хлористого и доводят дистиллированной водой до метки;

2) раствор экстрагирующего буфера подобный «RIDASCREEN Allergen extraction buffer» (далее - ЭБ-2), или с аналогичными характеристиками, готовят непосредственно перед его использованием. ЭБ-2 разводят в дистиллированной воде в 20 раз (1:19), например, смешав 2,5 см³ экстрагирующего буфера и 47,5 см дистиллированной воды.

9.1.2. Приготовление проб

Пробу мясопродукта (анализируемый образец) измельчают с использованием лабораторного гомогенизатора. Далее (12,0 ± 0,1) г гомогенизированной пробы помещают в стакан диспергатора, вносят 48 см³ PBS и проводят размельчение образца мясопродукта до однородной массы при 24000 об./мин.

Внимание! Каждую пробу анализируют в трех параллелях, т.е. готовят три экстракта анализируемого образца.

Для получения трех экстрактов анализируемого образца берут три аликвоты по 0,25 см³ диспергата, переносят их в три конические колбы и взвешивают на аналитических весах.

Внимание! Массу каждой аликвоты 0,25 см³ (g) учитывают в дальнейших расчетах п. 9.6.3.1. Вносят в каждую колбу по 2,5 см³ экстрагента подобный «RIDA Extraction Solution» (далее - ЭБ-1). Колбы закрывают крышками и помещают на нагревательную плиту при 60 °С на 90 мин (периодически встряхивая вручную). Затем в колбы вносят по 7,5 см³ предварительно нагретого до 60 °С ЭБ-2 и проводят инкубацию в течение 90 мин на нагревательной плите при 60 °С (периодически встряхивая вручную).

Далее охлаждают полученные экстракты до комнатной температуры. Экстракты готовы к проведению ИФА. Полученные экстракты допускается оставлять на 16 ч при 4 °С в холодильнике или в течение 2 недель при -20 °С. Размораживают на воздухе при комнатной температуре.

9.2. Подготовка стандартов ИБС

В качестве стандарта используют аттестованный образец ИБС с содержанием белка (83,4 ± 0,3) %, типа выпускаемой компанией «Sypro Hamburg» или с аналогичными характеристиками. Навеску ИБС (50,0 ± 0,1) мг растворяют в 2,5 см³ ЭБ-1 на нагревательной плите в конической колбе при закрытой крышке при 60 °С в течение 90 мин. Затем в колбу вносят 7,5 см³ предварительно нагретого до 60 °С ЭБ-2 и проводя инкубацию в течение 90 мин на нагревательной плите при 60 °С.

Затем полученный раствор охлаждают до комнатной температуры и объем доводят до 100 см³ 0,5 %-м водным раствором нормальной лошадиной сыворотки (НЛС). Полученный стандарт разливают по 2,0 см³ в стеклянные флаконы (вместимостью 6 - 12 см³) и после предварительного замораживания при температуре не выше -25 °С лиофильно высушивают. Условия лиофилизации являются стандартными для водных растворов белков и прописаны в инструкции по эксплуатации сушки.

9.3. Подготовка полистирольной планшеты - сенсибилизация планшеты (иммобилизация антигена, белка сои, на поверхности лунок планшета)

9.3.1. Подготовка антигена

Навеску (1,0 ± 0,05) г ИБС переносят в стеклянный флакон (вместимостью 15 - 30 см³) и добавляют 10,0 см³ PBS. Полученную смесь помещают на 3 ч на лабораторный встряхиватель при комнатной температуре. Затем взвесь центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об./мин. Отбирают супернатант.

9.3.2. Подготовка буфера для сенсибилизации планшеты
(0,1 М бикарбонатный буфер)

Навеску (4,00 ± 0,05) г натрия гидроксида переносят в мерную колбу на 100 см³ (навеску готовят на лабораторных весах), растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Навеску (8,40 ± 0,05) г натрия двууглекислого помещают в стакан на 1000 см³, растворяют в 800 - 900 см³ дистиллированной воды на магнитной мешалке. Добавляют раствор натрия гидроксида при перемешивании под контролем анализатора потенциометрического до достижения рН 9,7 ± 0,1. Смесь количественно переносят в мерную колбу на 1000 см³ и доводят дистиллированной водой до метки. Полученный раствор хранится при 4 °С в темноте в течение 1 месяца.

9.3.3. Сенсибилизация планшеты

Супернатант, полученный в п. 9.3.1, разводят 0,1 М бикарбонатным буфером в 100 раз (обозначается далее как сенсибилизирующий раствор), например, смешав 0,15 см³ супернатанта с 15 см³ 0,1 М бикарбонатного буфера. В лунки планшета вносят по 0,1 см³ сенсибилизирующего раствора, планшету закрывают крышкой и помещают на 16 ч в холодильник при 4 °С.

9.4. Подготовка реагентов для анализа

9.4.1. Подготовка фосфатного моющего буферного раствора
(0,1 %-й раствор Твина-20 в PBS)

В мерную колбу на 2000 см³ вносят 2 см³ Твина-20 и доводят PBS до метки. Полученный буфер хранится 48 ч в холодильнике при 4 °С.

9.4.2. Подготовка раствора желатина (1 %-й раствор желатина в PBS)

Смешивают (0,20 ± 0,01) г желатина с 20 см³ PBS, оставляют на 16 ч в холодильнике, после чего нагревают при 37 °С на водяной бане до полного растворения.

9.4.3. Подготовка раствора нормальной лошадиной сыворотки в PBS (НЛС-PBS)

Смешивают 100 см³ PBS с 0,5 см³ НЛС.

9.4.3. Подготовка растворов антител к соевому белку

Раствор антител к соевому белку готовят в разведениях 1/2000 и 1/4000 в НЛС-PBS. Антитела вносятся в предварительно отмеренный мерным цилиндром объем НЛС-PBS с использованием пипеточного дозатора переменного объема.

9.4.4. Подготовка раствора конъюгата

Раствор конъюгата готовят в разведении, указанном изготовителем на каждой партии сухого препарата, в HЛC-PBS.

9.4.5. Подготовка субстратного буфера (0,1 М цитратный буфер)

В стакан на 1000 см³ вносят навески (26,3 ± 0,2) г натрия фосфорно-кислого 2-замещенного 12-водного и 5,6 г лимонной кислоты моногидрата и растворяют в 800 - 900 см³ дистиллированной воды на магнитной мешалке. Количественно переносят в мерную колбу на 1000 см³, доводят до метки дистиллированной водой и измеряют рН на анализаторе потенциометрическом, значение которого должно составлять 6,0 ± 0,05.

9.4.6. Подготовка раствора субстрата
(готовят непосредственно перед употреблением)

Навеску (21,0 ± 0,5) мг орто-фенилендиамина, взятую на аналитических весах (за 30 мин до проведения реакции), вносят в предварительно нагретую (до 40 - 50 °С) емкость с 40 см³ субстратного буфера и выдерживают в темноте в течение 30 мин (в суховоздушном термостате при 37 °С). Непосредственно перед внесением в лунки планшеты в раствор субстрата добавляют 0,15 см³ 16 % перекиси водорода.

9.4.7. Подготовка стоп-реагента (0,5 Н раствор серной кислоты)

В мерную колбу на 1000 см³ вносят 900 - 950 см³ дистиллированной воды и отмеряют цилиндром 28 см³ серной кислоты. Раствор перемешивают, охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до метки.

9.5. Процедура анализа

9.5.1. Готовят стандартный раствор ИБС путем количественного перенесения лиофилизованного стандарта в мерный цилиндр и доведения конечного объема до 20 см³ HЛC-PBS. После использования остающийся раствор стандарта следует замораживать при температуре -20 °С. Данный стандарт пригоден к повторному использованию после оттаивания (допускается пятикратное замораживание-оттаивание). В замороженном состоянии может храниться в течение 2 месяцев.

9.5.2. Готовят исходные разведения исследуемых образцов путем смешивания в отдельном флаконе 0,8 см³ HЛC-PBS и 0,2 см³ экстракта мясопродукта.

9.5.3. Выливают сенсибилизирующий раствор из лунок, перевернув планшет, и выбивают капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания планшета по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполняют лунки 0,2 см³ раствора фосфатного моющего буфера и снова удаляют раствор из лунок. Выбивают капли жидкости, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок раствором фосфатного моющего буфера еще 1 раз.

9.5.4. Добавляют в каждую лунку по 0,2 см³ раствора желатина и инкубируют 30 мин при комнатной температуре.

9.5.5. Выливают жидкость из лунок, перевернув планшет, и выбивают капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания планшета по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполняют лунки 0,2 см³ раствора фосфатного моющего буфера и снова удаляют раствор из лунок. Выбивают капли жидкости, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок раствором фосфатного моющего буфера еще 2 раза.

9.5.6. Добавляют в лунки А1-В1 планшета по 0,1 см³ стандартного раствора ИБС (далее - Ст. ИБС). Добавляют в лунки C1-D1 по 0,1 см³ исходного разведения первого экстракта из анализируемого образца (П1). Добавляют в лунки E1-F1 по 0,1 см³ исходного разведения второго экстракта из анализируемого образца (П2). Добавляют в лунки G1-H1 по 0,1 см³ исходного разведения третьего экстракта из анализируемого образца (П3).

Таблица 1

Разметка планшеты при определении ИБС в колбасных изделиях

• Ст. ИБС - первое разведение стандартного раствора ИБС;

• П1, П2, П3 - параллели исходных разведений экстрактов из анализируемого колбасного изделия;

• Б(0) - столбец, соответствующий нулевому связыванию коньюгата;

• НСС - неспецифическая сорбция (ряд без внесения антител).

9.5.7. Добавляют в лунки А12-Н12 по 0,1 см³ НЛС-PBS.

9.5.8. Добавляют в лунки А2-Н11 по 0,1 см³ кроличьей антисыворотки против соевого белка в разведении 1:4000 в HЛC-PBS.

9.5.9. Добавляют немедленно после этого в лунки А1-Н1 по 0,1 см³ антисыворотки в разведении 1:2000 в PBS-НЛС и титруют ряды 1 - 10 в серии двоичных разведений с помощью 8-канальной пипетки с установленным объемом 0,1 см³.

9.5.10. Планшет инкубируют на встряхивателе 2 ч при комнатной температуре, после чего выливают жидкость из лунок, перевернув планшет, и выбивают капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания планшета по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполняют лунки 0,2 см³ раствора фосфатного моющего буфера и снова удаляют раствор из лунок. Выбивают капли жидкости, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок раствором фосфатного моющего буфера еще 3 раза.

9.5.11. Добавляют в каждую лунку по 0,1 см³ раствора конъюгата. Оставляют на инкубацию в течение 90 мин при комнатной температуре.

9.5.12. Выливают жидкость из лунок, перевернув планшет, и выбивают капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания планшета по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполняют лунки 0,2 см³ раствора фосфатного моющего буфера и снова удаляют раствор из лунок. Выбивают капли жидкости, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок раствором фосфатного моющего буфера еще 4 раза.

9.5.13. Добавляют в каждую лунку по 0,1 см³ раствора субстрата. Оставить инкубировать на 20 мин при 37 °С в воздушном термостате.

9.5.14. Добавляют в каждую лунку по 0,1 см стоп-реагента. В течение не более 60 мин после добавления стоп-реагента измеряют оптическую плотность в каждой лунке при длине волны 492 нм на планшетном фотометре.

9.6. Обработка результатов

Расчеты производятся с использованием пакета программ Microsoft Excel.

Среднее значение оптических плотностей растворов в лунках ряда А12-Н12 (НССср) вычитается из значений всех оптических плотностей растворов в остальных лунках (с использованием либо функции автоматического вычета фона прибора «Эфос9305» либо вручную).

9.6.1. Построение калибровочной кривой стандартного раствора ИБС

Рассчитывают % связывания конъюгата для каждого разведения стандартного раствора ИБС по формуле (J(n) (%)):

 где                                           (1)

Б₀(n) - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для нулевого связывания;

Бn - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для каждого разведения стандартного раствора ИБС.

Строят калибровочную кривую стандартного раствора ИБС в координатах: ось абсцисс - % связывания конъюгата (J (%)), ось ординат - десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИБС (мкг/мл) (Lg С_{(мкг/мл)}).

9.6.2. Расчет концентрации стандартного раствора ИБС, соответствующей 50 %-му связыванию конъюгата

9.6.2.1. По калибровочной кривой стандартного раствора ИБС методом линейной интерполяции рассчитывают логарифм концентрации стандартного раствора ИБС, соответствующей 50 %-му связыванию конъюгата, (Lg (ИБС, 50 %):

 где                       (2)

Lg C_1cm - десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИБС, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается более 50 % конъюгата;

Lg C_2cm - десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИБС, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается менее 50 % конъюгата;

J_1cm - % связывания конъюгата, соответствующий Lg C_1cm;

J_2cm - % связывания конъюгата, соответствующий Lg C_2cm.

9.6.2.2. Рассчитывают концентрацию стандартного раствора ИБС (С_{ИБС 50 %} (мкг/мл), соответствующую 50 %-му связыванию конъюгата, по формуле:

                                                   (3)

9.6.3. Расчет концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей 50 %-му связыванию конъюгата

9.6.3.1. Рассчитывают концентрацию раствора исследуемого образца, соответствующую первому разведению (ряд 1 полистирольной планшеты) по формуле:

 где                                                (4)

С (мкг/мл) - концентрация раствора исследуемого образца в первом разведении;

g - масса 0,25 см³ диспергата, мг (п. 9.1.2 «Приготовление проб»).

9.6.3.2. Рассчитывают % связывания конъюгата для каждого разведения раствора анализируемого образца по формуле (J(n) (%)):

 где                                              (5)

Б₀(п) - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для нулевого связывания;

Б(п) - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для каждого разведения раствора анализируемого образца.

Далее строят кривую раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца в координатах: ось абсцисс - % связывания конъюгата (J (%), ось ординат - десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца (Lg С_{(мкг/мл)}).

9.6.3.3. По кривой раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца методом линейной интерполяции рассчитывают логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующий 50 %-му связыванию конъюгата (Lg (П, 50 %):

 где                           (6)

Lg C_2П - десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается менее 50 % конъюгата;

Lg С_1П - десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается более 50 % конъюгата;

J_2П - % связывания метки, соответствующий Lg С_2П;

J_1П - % связывания метки, соответствующий Lg С_1П.

9.6.3.4. Концентрацию раствора исследуемого образца, соответствующую 50 %-му связыванию конъюгата, рассчитывают по формуле:

                                                        (7)

9.6.4. Расчет содержания ИБС в анализируемом образце колбасного изделия

Рассчитывают содержание ИБС в исследуемом образце (г на 100 г колбасного изделия) по формуле:

                                              (8)

9.7. Пример расчета содержания ИБС в анализируемом образце (колбасном изделии)

По калибровочной кривой стандартного раствора ИБС (содержание белка в стандарте ИБС (83,8 ± 0,3) %) определяют концентрацию стандартного раствора ИБС и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (С_1cm и Lg C_1cm), при которых связывается более 50 % конъюгата (J_1cm):

J_1cm = 53,5 %;

С_1cm = 1,56 мкг/мл;

Lg C_1cm = 0,194.

Далее аналогичным образом определяют концентрацию стандартного раствора ИБС и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (С_2cm и Lg C_2cm), при которых связывается менее 50 % конъюгата (J_2cm):

J_2cm = 39,2 %;

С_2cm = 0,78 мкг/мл;

Lg C_2cm = -0,107.

По формуле (2) рассчитывают десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИБС, соответствующей 50 %-му связыванию конъюгата (Lg (ИБС, 50 %):

По формуле (3) рассчитывают концентрацию стандартного раствора ИБС (С_{ИБС 50%} (мкг/мл), соответствующую 50 %-му связыванию конъюгата:

С_{ИБС 50%} = 10^0,121 = 1,32 мкг/мл.

По калибровочной кривой раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца определяют концентрацию раствора исследуемого образца и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (С_1П и Lg С_1П), при которых связывается более 50 % конъюгата (J_1П):

J_1П = 51,3 %;

С_1П = 137,5 мкг/мл;

Lg С_1П = 2,138.

Далее аналогичным образом определяют концентрацию раствора исследуемого образца и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (С_2П и Lg С_2П), при которых связывается менее 50 % конъюгата (J_2П):

J_2П = 39,9 %;

С_2П = 68,75 мкг/мл;

Lg С_2П = 1,837.

По формуле (6) рассчитывают десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей 50 %-му связыванию конъюгата (Lg (П, 50 %):

По формуле (7) рассчитывают концентрацию раствора исследуемого образца (С_{П 50%} (мкг/мл), соответствующую 50 %-му связыванию конъюгата:

С_{П 50%} = 10^2,103 = 126,97 мкг/мл.

Рассчитывают содержание ИБС в исследуемом образце (г/100 г) по формуле (8):

Для каждого из трех взятых экстрактов анализируемого образца (п. 9.1.2 «Приготовление проб») строят свою кривую раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца и рассчитывают содержание ИБС_(N), как описано выше:

ИБС₁ = 1,04 г/100 г;

ИБС₂ = 0,95 г/100 г;

ИБС₃ = 1,04 г/100 г.

Среднее значение содержания ИБС в анализируемом образце соответственно равно:

10. Определение соевого белка в мясных консервах

10.1. Подготовка проб

Отбор образцов для анализа ведут в соответствии с п. 3 настоящих методических указаний. Образцы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодильнике без доступа света.

10.1.1. Подготовка реагентов для пробоподготовки

Проводится так же, как и в п. 9.1.1 «Подготовка реагентов для пробоподготовки».

10.1.2. Приготовление проб

Пробу мясопродукта (анализируемый образец) измельчают с использованием лабораторного гомогенизатора. Далее (12,0 ± 0,1) г гомогенизированной пробы помещают в стакан диспергатора, вносят 48 см³ PBS и проводят размельчение образца мясопродукта до однородной массы при 24000 об./мин.

Внимание! Каждую пробу анализируют в четырех параллелях, т.е. готовят четыре экстракта анализируемого образца.

Для получения четырех экстрактов анализируемого образца берут четыре аликвоты по 0,25 см³ диспергата, переносят их в четыре конические колбы и взвешивают на аналитических весах.

Внимание! Массу каждой аликвоты 0,25 см³ (g) учитывают в дальнейших расчетах п. 10.6.3.1. В каждую колбу вносят по 2,5 см³ ЭБ-1. Колбы закрывают крышками и помещают на нагревательную плиту при 60 °С на 90 мин (периодически встряхивая). Затем в колбы вносят по 7,5 см³ предварительно нагретого до 60 °С ЭБ-2 и проводят инкубацию в течение 90 мин на нагревательной плите при 60 °С (периодически встряхивая).

Далее охлаждают полученные экстракты до комнатной температуры. Экстракты готовы к проведению ИФА. Допускается оставлять полученные экстракты на 16 ч при 4 °С в холодильнике или в течение 2 недель при -20 °С. Размораживают на воздухе при комнатной температуре.

10.2. Подготовка стандартных образцов

В работе используются два стандартных образца с известным содержанием ИБС.

Первый стандарт готовят, как в п. 9.2 «Подготовка стандартов ИБС».

Для приготовления второго стандартного образца (Rf-стандарта) используются мясные консервы с известным содержанием ИБС (4 %), Предварительно измельченный образец консервов взвешивают и лиофильно высушивают. Далее лиофилизованный образец взвешивают, измельчают в фарфоровой ступке и рассчитывают отношение масс консервов после и до лиофилизации (K_влаж). Навеску лиофильно высушенных консервов для экстракции в ЭБ-1 и ЭБ-2 рассчитывают по следующей формуле:

g_Rf(r) = (12,0 ± 0,1 г) ∙ K_влаж                                             (9)

Навеску g диспергируют в 48,0 см³ PBS с помощью диспергатора (24000 об./мин). 0,25 см³ полученной взвеси переносят в коническую колбу и вносят 2,5 см³ ЭБ-1. Инкубацию ведут при 60 °С 90 мин. Затем в колбу вносят 7,5 см³ предварительно нагретого до 60 °С ЭБ-2 и проводят инкубацию в течение 90 мин на нагревательной плите при 60 °С.

После охлаждения до комнатной температуры образец растворяют в соотношении 1:4 в 0,5 %-м водном растворе НЛС, разливают по 2,0 см³ во флаконы и лиофильно высушивают. Лиофильно высушенный образец используют в дальнейшем при проведении ИФА.

10.3. Подготовка полистирольной планшеты (сенсибилизация планшеты)

Проводится так же, как и в п. 9.3 «Подготовка полистирольной планшеты (сенсибилизация планшета)».

10.4. Подготовка реагентов для анализа

Проводится так же, как и в п. 9.2 «Подготовка реагентов для анализа».

10.5. Процедура анализа

10.5.1. Готовят раствор первого стандартного образца путем количественного перенесения лиофилизованного стандарта в мерный цилиндр и доведения конечного объема до 20 см³ НЛС-PBS. После использования остающийся раствор стандарта следует замораживать при -20 °С. Данный стандарт пригоден к повторному использованию после оттаивания (допускается пятикратное замораживание-оттаивание). В замороженном состоянии может храниться в течение 2 месяцев.

10.5.2. Готовят раствор второго стандартного образца путем внесения во флакон с высушенным стандартом (Rf-стандартом) 2 см³ НЛС-PBS.

10.5.3. Готовят исходные разведения исследуемых образцов путем смешивания в отдельном флаконе 0,8 см³ НЛС-PBS и 0,2 см³ экстракта мясопродукта.

10.5.4. Выливают сенсибилизирующий раствор из лунок, перевернув планшет, и выбивают капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания планшета по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполняют лунки 0,2 см³ раствора фосфатного моющего буфера и снова удаляют раствор из лунок. Выбивают капли жидкости, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок раствором фосфатного моющего буфера еще 1 раз.

10.5.5. Добавляют в каждую лунку по 0,2 см³ раствора желатины и инкубируют 30 мин при комнатной температуре.

10.5.6. Выливают жидкость из лунок, перевернув планшет, и выбивают капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания планшета по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполняют лунки 0,2 см³ раствора фосфатного моющего буфера и снова удаляют раствор из лунок. Выбивают капли жидкости, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок раствором фосфатного моющего буфера еще 2 раза.

10.5.7. Добавляют в лунки А1-В1 планшет по 0,1 см³ раствора первого стандартного образца. Добавляют в лунки C1-D1 планшет по 0,1 см³ раствора второго стандартного образца. Добавляют в лунки Е1-F1 первой планшеты по 0,1 см³ исходного разведения первого экстракта из анализируемого образца. Добавляют в лунки G1-H1 первой планшеты по 0,1 см³ исходного разведения второго экстракта. Добавляют в лунки E1-F1 второй планшеты по 0,1 см³ исходного разведения третьего экстракта из анализируемого образца. Добавляют в лунки G1-H1 второй планшеты по 0,1 см³ исходного разведения четвертого экстракта.

Таблица 2

Разметка планшет при определении ИБС в мясных консервах

 

• Ст. ИБС - первое разведение раствора первого стандартного образца;

• Rf-ст - первое разведение раствора второго стандартного образца;

• П1, П2, П3, П4 - параллели экстрактов анализируемых мясных консервов;

• Б(0) - столбец, соответствующий нулевому связыванию;

• НСС - неспецифическая сорбция (ряд без внесения антител).

10.5.8. Далее по пунктам 9.5.7 - 9.5.14.

10.6. Обработка результатов

Расчеты производятся с использованием пакета программ Microsoft Excel.

Среднее значение оптических плотностей растворов в лунках ряда А12-H12 (НССср) вычитается из значений всех оптических плотностей растворов в остальных лунках (с использованием либо функции автоматического вычета фона прибора «Эфос9305» либо вручную).

10.6.1. Построение калибровочной кривой раствора первого стандартного образца

Рассчитывают % связывания конъюгата для каждого разведения раствора первого стандартного образца по формуле (J(n) (%):

 где                             (по формуле 5)

Б₀(п) - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для нулевого связывания;

Б(п) - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для каждого разведения раствора первого стандартного образца.

Строят калибровочную кривую раствора первого стандартного образца в координатах: ось абсцисс - % связывания конъюгата (J (%), ось ординат - десятичный логарифм концентрации раствора первого стандартного образца (мкг/мл) (Lg С_{(мкг/мл)}).

10.6.2. Расчет концентрации раствора первого стандартного образца, соответствующей 50 %-му связыванию конъюгата

10.6.2.1. По калибровочной кривой раствора первого стандартного образца методом линейной интерполяции рассчитывают логарифм концентрации раствора первого стандартного образца, соответствующей 50 %-му связыванию конъюгата (Lg (ИБС, 50 %):

 где                      (10)

Lg C_1cm - десятичный логарифм концентрации раствора первого стандартного образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается более 50 % конъюгата;

Lg С_2ст - десятичный логарифм концентрации раствора первого стандартного образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается менее 50 % конъюгата;

J_1cm - % связывания конъюгата, соответствующий Lg 1_ст;

J_2cm - % связывания конъюгата, соответствующий Lg 2_ст.

10.6.2.2. Рассчитывают концентрацию раствора первого стандартного образца (С_{ИБС 50%} (мкг/мл), соответствующую 50 %-му связыванию конъюгата, по формуле:

                                                   (11)

10.6.3. Расчет концентрации раствора второго стандартного образца, соответствующей 50 %-му связыванию конъюгата

10.6.3.1. Рассчитывают концентрацию раствора второго стандартного образца, соответствующую первому разведению (ряд 1 полистирольной планшеты), по формуле:

 где                                             (12)

С_Rf (мкг/мл) - концентрация раствора второго стандартного образца в первом разведении;

g_Rf - масса 0,25 см³ диспергата, мг (п. 10.2 «Подготовка стандартных образцов»).

10.6.3.2. Рассчитывают % связывания конъюгата для каждого разведения раствора второго стандартного образца по формуле (J_Rf(n) (%):

 где                                          (13)

Б₀(п) - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для нулевого связывания;

Б(п) - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для каждого разведения раствора второго стандартного образца.

Далее строят калибровочную кривую раствора второго стандартного образца в координатах: ось абсцисс - % связывания конъюгата (J (%), ось ординат - десятичный логарифм концентрации раствора второго стандартного образца (Lg С_{Rf(мкг/мл)}).

10.6.3.3. По калибровочной кривой раствора второго стандартного образца методом линейной интерполяции рассчитывают логарифм концентрации раствора второго стандартного образца, соответствующий 50 %-му связыванию конъюгата (Lg (Rf, 50 %):

 где                    (14)

Lg C_2Rf - десятичный логарифм концентрации раствора второго стандартного образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается менее 50 % конъюгата;

Lg C_1Rf - десятичный логарифм концентрации раствора второго стандартного образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается более 50 % конъюгата;

J_2Rf - % связывания метки, соответствующий Lg C_2Rf;

J_1Rf - % связывания метки, соответствующий Lg C_1Rf.

10.6.4. Расчет коэффициента открытия ИБС в мясных консервах

10.6.4.1. Рассчитывают концентрацию раствора второго стандартного образца (Rf-стандарта), соответствующую 50 %-му связыванию конъюгата, по формуле:

                                                    (15)

10.6.4.2. Рассчитывают содержание ИБС в Rf-стандарте в % по формуле (это кажущееся содержание ИБС по калибровочной кривой раствора первого стандартного образца содержание):

                                                    (16)

10.6.4.3. Рассчитывают коэффициент открытия ИБС в мясных консервах по формуле:

                                                    (17)

10.6.5. Расчет концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей 50 %-му связыванию конъюгата

10.6.5.1. Рассчитывают концентрацию раствора исследуемого образца, соответствующую первому разведению (ряд 1 полистирольной планшеты), по формуле:

 где                                                  (18)

С (мкг/мл) - концентрация раствора исследуемого образца в первом разведении;

g - масса 0,25 см³ диспергата, мг (п. 10.1.2 «Приготовление проб»).

10.6.5.2. Рассчитывают % связывания конъюгата для каждого разведения раствора анализируемого образца по формуле (J(n) (%):

 где                                             (19)

Б₀(п) - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для нулевого связывания;

Б(п) - среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для каждого разведения раствора анализируемого образца.

Далее строят кривую раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца в координатах: ось абсцисс - % связывания конъюгата (J (%), ось ординат - десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца (Lg С_{(мкг/мл)}).

10.6.5.3. По кривой раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца методом линейной интерполяции рассчитывают логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующий 50 %-му связыванию конъюгата (Lg (П, 50 %):

 где                         (20)

Lg С_2П - десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается менее 50 % конъюгата;

Lg С_1П - десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается более 50 % конъюгата;

J_2П - % связывания метки, соответствующий Lg С_2П;

J_1П - % связывания метки, соответствующий Lg С_1П.

10.6.5.4. Концентрацию раствора исследуемого образца соответствующую 50 %-му связыванию конъюгата, рассчитывают по формуле:

                                                      (21)

10.6.6. Расчет содержания ИБС в анализируемом образце мясных консервов

Рассчитывают содержание ИБС в исследуемом образце (в г на 100 г мясных консервов) по формуле:

ИБС = 100С_{ИБС 50%}/С_{П 50%}/К_{откр.ИБС}                                            (22)

10.7. Пример расчета содержания ИБС в анализируемом образце (мясных консервах)

По калибровочной кривой раствора первого стандартного образца определяют концентрацию раствора ИБС и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (С_1ст и Lg C_1cm), при которых связывается более 50 % конъюгата (J_1cm):

J_1cm = 61,6 %;

C_1cm = 3,09 мкг/мл;

Lg C_1cm = 0,490.

Далее аналогичным образом определяют концентрацию раствора первого стандартного образца и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (С_2ст и Lg C_2cm), при которых связывается менее 50 % конъюгата (J_2cm):

J_2cm = 48,6 %;

С_2ст = 1,54 мкг/мл;

Lg C_2cm = 0,189.

По формуле (10) рассчитывают десятичный логарифм концентрации раствора первого стандартного образца, соответствующей 50 %-му связыванию конъюгата (Lg (ИБС, 50 %):

По формуле (11) рассчитывают концентрацию раствора первого стандартного образца (С_{ИБС 50 %} (мкг/мл), соответствующую 50 %-му связыванию конъюгата:

С_{ИБС 50 %} = 10^0,223 = 1,67 мкг/мл

По калибровочной кривой раствора второго стандартного образца определяют концентрацию раствора Rf-стандарта и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (С_1Rf и Lg C_1Rf), при которых связывается более 50 % конъюгата (J_1Rf):

J_1Rf = 51,8 %;

C_1Rf = 73,11 мкг/мл;

Lg C_1Rf = 1,864.

Далее аналогичным образом определяют концентрацию раствора первого стандартного образца и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (С_2Rf и Lg C_2Rf), при которых связывается менее 50 % конъюгата (J_2Rf):

J_2Rf = 34,8 %;

C_2Rf = 36,56 мкг/мл;

Lg_2Rf = 1,563.

По формуле (14) рассчитывают десятичный логарифм концентрации раствора второго стандартного образца, соответствующей 50 %-му связыванию конъюгата (Lg (Rf, 50 %):

По формуле (15) рассчитывают концентрацию раствора второго стандартного образца (С_{Rf 50 %} (мкг/мл), соответствующую 50 %-му связыванию конъюгата:

С_{Rf 50 %} = 10^1,831 = 67,82 мкг/мл.

По формуле (16) рассчитывают содержание ИБС в Rf-стандарте в % (это кажущееся содержание ИБС по калибровочной кривой раствора первого стандартного образца содержание):

По формуле (17) рассчитывают коэффициент открытия ИБС в мясных консервах:

По калибровочной кривой раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца определяют концентрацию раствора исследуемого образца и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (С_1П и Lg C_1П), при которых связывается более 50 % конъюгата (J_1П):

J_1П = 57,4 %;

С_1П = 292,8 мкг/мл;

Lg С_1П = 2,466.

Далее аналогичным образом определяют концентрацию раствора исследуемого образца и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (С_2П и Lg С_2П), при которых связывается менее 50 % конъюгата (J_2П):

J_2П = 46,1%;

С_2П = 146,4 мкг/мл;

Lg C_2П = 2,165.

По формуле (20) рассчитывают десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей 50 %-му связыванию конъюгата, (Lg (П, 50 %):

По формуле (21) рассчитывают концентрацию раствора исследуемого образца (С_{П 50 %} (мкг/мл), соответствующую 50 %-му связыванию конъюгата:

С_{П 50 %} = 10^2,270 = 186,1 мкг/мл.

Рассчитывают содержание ИБС в исследуемом образце (в г/100 г) по формуле (22):

ИБС = 100∙1,67/186,1/0,615 = 1,46 г/100 г.

Для каждого из четырех взятых экстрактов анализируемого образца (п. 10.1.2 «Приготовление проб») строят свою кривую раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца и рассчитывают содержание ИБС_(N), как описано выше:

ИБС₁ = 1,46 г/100 г;

ИБС₂ = 1,49 г/100 г;

ИБС₃ = 1,52 г/100 г;

ИБС₄ = 1,54 г/100 г.

Среднее значение содержания ИБС в анализируемом образце соответственно равно:

ИБС_ср = (1,46 + 1,49 + 1,58 + 1,54)/4 = 1,50 г/100 г.

11. Оценка приемлемости результатов параллельных определений

11.1. Проверяют приемлемость полученных результатов параллельных определений. Расхождение между минимальным и максимальным из полученных N (N = 3 для колбасных изделий, N = 4 для мясных консервов) результатов параллельных определений анализируемой пробы не должно превышать предела повторяемости r_m, приведенного в табл. 1 для колбасных изделий и табл. 2 для мясных консервов.

Результаты считают приемлемыми при выполнении условия:

(x_max - x_min) ≤ r_m,                                                      (23)

где х_max, х_min - максимальное и минимальное значения n результатов параллельных определений соответственно, г/100 г.

Если выполняется условие приемлемости (23) за результат измерений принимают среднее арифметическое n параллельных определений.

11.2. Если условие (23) не выполняется, получают еще n результатов параллельных определений анализа. За результат измерений принимают среднее арифметическое значение результатов 2n определений, если выполняется условие:

(х_max - х_min) ≤ CR_0,95(2n)                                               (24)

CR_0,95(2n) = f(2n)σ_r, где                                              (25)

х_max, x_min - максимальное и минимальное значения из полученных 2n результатов параллельных определений ИБС, г/100 г;

CR_0,95 - значение критического диапазона для уровня вероятности Р = 0,95;

f(n) - коэффициент критического диапазона (f(6) (для колбасных изделий) = 4,0; f(8) для мясных консервов = 4,3);

Если условие (24) не выполняется, выполнение анализов прекращают, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

12. Оформление результатов измерений

Результат количественного определения ИБС в мясных продуктах методом конкурентного ИФА представляют в виде:

(Х ± Δ), г/100 г ИБС в мясном продукте, при доверительной вероятности Р = 0,95, где Х - результат измерений, полученный в соответствии с настоящей методикой; Δ - абсолютная погрешность измерений, г/100 г при доверительной вероятности Р = 0,95.

Результаты анализа оформляют протоколом.

13. Контроль качества результатов измерений

13.1. Контроль промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности

При контроле промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности абсолютное значение разности двух результатов анализа |X₁ - X₂| одной и той же пробы, полученных в условиях промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности, не должно превышать предела промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности R_m, т.е. с доверительной вероятностью Р = 0,95 должно выполняться условие:

|X₁ - X₂| ≤ R_m.                                                          (26)

Значения R_m приведены в табл. 3 для колбасных изделий и табл. 4 для мясных консервов.

Если указанное соотношение не выполняется, выполнение анализов прекращают, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

13.2. Контроль правильности результатов анализа

Контроль правильности результатов анализа проводят раз в год путём анализа контрольных образцов. В качестве контрольных образцов могут быть использованы образцы мясных продуктов с заранее известным содержанием ИБС.

Абсолютное значение разности результата анализа контрольного образца (X) и принятого опорного значения (Х_ат) не должно превышать критического значения К, т.е. с доверительной вероятностью Р = 0,95 должно выполняться условие:

|X - X_am| ≤ K.                                                         (27)

Критическое значение K вычисляют по формуле:

 где                                                      (28)

Δ_am - погрешность установления опорного значения содержания ИБС в контрольном образце;

Δ - граница интервала, в котором с вероятностью Р = 0,95 находится погрешность результата анализа X. Значения Δ приведены в табл. 3 для колбасных изделий и табл. 4 для мясных консервов.

Таблица 3

Основные метрологические показатели методики количественного
определения ИБС методом непрямого ИФА в колбасных изделиях

Таблица 4

Основные метрологические показатели методики количественного
определения ИБС методом непрямого ИФА в мясных консервах

Результат вычислений округляют до первого значащего знака после запятой.