4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Руководство по методам контроля
качества и безопасности
биологически активных добавок к пище

Руководство Р 4.1.1672-03

МИНЗДРАВ РОССИИ

МОСКВА

2004

Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.

1. Разработано: ГУ НИИ питания РАМН (руководитель В.А. Тутельян, ответственный исполнитель К.И. Эллер, Ю.П. Алешко-Ожевский, Т.В. Аристархова, В.Г. Байков, Н.А. Бекетова, В.В. Бессонов, С.В. Волкович, Л.Ш. Воробьева, О.А. Вржезинская, М.Г. Гаппаров, Н.А. Голубкина, Г.Ф. Жукова, М.Г. Киселева, Т.В. Киселева, В.М. Коденцова, С.Н. Кулакова, Л.Г. Левин, Ф.А. Медведев, Г.В. Никольская, В.В. Пименова, И.М. Скурихин, О.И. Соловьева, В.Б. Спиричев, Л.А. Харитончик, С.А. Хотимченко); Департаментом Госсанэпиднадзора Минздрава России (А.И. Петухов); Федеральным центром Госсанэпиднадзора Минздрава России (И.В. Брагина); Фармакопейным комитетом Минздрава России (В.Л. Багирова, Е.Л. Ковалева); ВИЛАР РАСХН (С.А. Пинеев).

2. Утверждено и введено в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 30 июня 2003 г.

3. Вводится впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

УТВЕРЖДАЮ

Главный государственный

санитарный врач Российской Федерации,

Первый заместитель Министра

здравоохранения Российской Федерации

Г. Г. Онищенко

30 июня 2003 г.

Дата введения 30 июня 2003 г.

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Руководство по методам контроля
качества и безопасности
биологически активных добавок к пище

Область применения

Настоящее Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище (далее - руководство) разработано в соответствии с Федеральными законами «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30.03.99 № 52-ФЗ (Собрание законодательства Российской Федерации, 1999, № 14, ст. 1650), «О качестве и безопасности пищевых продуктов» от 02.01.00 № 29-ФЗ (Собрание законодательства Российской Федерации, 2000, № 2, ст. 150), постановлением Правительства Российской Федерации от 21.12.00 № 987 «О государственном надзоре и контроле в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов».

Руководство устанавливает методы контроля ингредиентного состава и показателей качество и безопасности биологически активных добавок к пище (далее - БАД).

Руководство предназначено для юридических лиц и индивидуальных предпринимателей, осуществляющих деятельность в сфере производства и оборота БАД, а также для организаций и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации (далее - госсанэпидслужбы России), осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор и контроль за безопасностью и эффективностью БАД в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» и другими нормативными документами.

Методы контроля, изложенные в руководстве, применяются на этапах экспертизы и регистрации БАД, при разработке и производстве БАД, их ввозе, хранении, транспортировке и реализации на территории Российской Федерации, при разработке нормативной и технической документации, регламентирующей вопросы обращения БАД.

Глава 1

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАКРОНУТРИЕНТОВ

I. Методы определения азотистых соединений

1. Метод определения общего белка

Метод заключается в определении азота по Кьельдалю с последующим пересчетом на белок. Сущность метода состоит в разложении органического вещества пробы кипящей концентрированной серной кислотой с образованием солей аммония, переведении аммония в аммиак, отгонке его в раствор кислоты, количественном учете аммиака титрометрическим методом и расчете содержания азота в исследуемом материале.

Подготовка к испытанию

Среднюю пробу БАД готовят согласно прописи отбора проб по стандарту определения белка на соответствующий продукт, в случае отсутствия стандарта - по техническим условиям на БАД. Для пересчета содержания белка на сухое вещество (в случае необходимости определения данного показателя) определяют влажность исследуемого БАД или пищевого сырья.

Подготовка реактивов и растворов

Приготовление смешанных катализаторов

Катализатор 1. Смешивают 1 весовую часть сернокислой меди и 30 весовых частей сернокислого калия, тщательно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.

Катализатор 2. Смешивают 10 весовых частей сернокислой меди, 100 весовых частей сернокислого калия и 2 весовые части селена. Тщательно растирают в ступке до получения мелкозернистого порошка.

При приготовлении катализаторов 1 и 2 допускается заменять сернокислый калий надсернокислым калием в том же количестве.

Катализатор 3. Перекись водорода, 30 %-ный водный раствор.

Приготовление 4 %-ного раствора борной кислоты

40 г борной кислоты растворяют в небольшом количестве теплой дистиллированной воды при нагревании и переносят в колбу вместимостью 1000 см³. После охлаждения доводят объем дистиллированной водой до 1000 см³.

Приготовление 0,05 моль/дм³ (0,1 н) раствора серной кислоты

Используют стандарт-титр серной кислоты. Раствор готовят в соответствии с правилами, приложенными к комплекту.

Допускается приготовление 0,05 моль/дм³ раствора серной кислоты из концентрированной серной кислоты в соответствии с ГОСТ 25791.1-83.

Приготовление смешанного индикатора

Растворяют 0,20 г метилового красного и 0,10 г бромкрезолового зеленого в 100 см³ 96 %-ного этилового спирта.

Проведение испытания

Приготовление минерализата

Из усредненной измельченной гомогенной пробы исследуемого БАД для анализа взвешивают на обеззоленном фильтре или в пробирке точную навеску, с погрешностью не более 0,1 %. Содержание азота в анализируемой пробе должно быть не менее 10 мг. Навеску количественно переносят в колбу Къельдаля.

Минерализацию осуществляют одним из двух способов.

Способ 1

Добавляют в колбу Къельдаля 1,5 - 2 г смешанного катализатора 1 или 2. После прибавления катализатора осторожно приливают 10 - 15 см³ концентрированной серной кислоты.

Способ 2

Добавляют в колбу Къельдаля 7 - 10 см³ 30 %-ной перекиси водорода в качестве окислителя. После прекращения бурной реакции приливают такое же количество концентрированной серной кислоты.

Колбу покрывают стеклянной воронкой и устанавливают на нагреватель так, чтобы ее ось была наклонена под углом 30 - 45° к вертикали. Вначале коблу нагревают умеренно, чтобы предотвратить бурное пенообразование.

При нагревании навеску время от времени помешивают вращательными движениями колбы. После исчезновения пены нагревание усиливают, пока жидкость не будет доведена до постоянного кипения. При этом следят за тем, чтобы на стенках колбы не оставалось черных несгоревших частиц, смывая их легким встряхиванием содержимого колбы или прибавлением небольшого количества серной кислоты.

После того как жидкость обесцветится (допускается слегка зеленоватый оттенок), нагрев продолжают в течение 30 мин.

После охлаждения к содержимому колбы постепенно приливают, взбалтывая, около 70 см³ дистиллированной воды, охлаждают и приступают к отгонке аммиака.

В бачок-парообразователь через воронку наливают дистиллированную воду (несколько больше половины общего объема бачка) и открывают кран на воронке и зажим на отводящей пар трубке в колбу Къельдаля.

Нагревают воду в бачке на газовой горелке или электрической плитке. Присоединяют пустую колбу Къельдаля к каплеуловителю холодильника и воронке для щелочи и после того, как вода в бачке закипит, закрывают кран воронки бачка-парообразователя. Включают холодильник, подставляют под него пустую коническую колбу и в течение 5 - 10 мин «пропаривают» прибор.

После пропаривания открывают краны воронки бачка-парообразователя и воронки для щелочи и закрывают зажим на отводящей пар трубке в колбу Къельдаля.

Под холодильник подставляют вместо пустой конической колбы коническую колбу с предварительно налитыми в нее из пипетки 20 см³ 4 %-ной борной кислоты и 5 капель смешанного индикатора или 25 см³ 0,05 моль/дм³ раствора серной кислоты. Колбу подставляют под холодильник так, чтобы его кончик был погружен в раствор кислоты на глубину не менее чем 1 см. Вместо пустой колбы Къельдаля присоединяют колбу с сожженной навеской анализируемой пробы.

Закрывают кран воронки для щелочи, наливают в воронку 33 % раствора щелочи и открывают понемногу кран воронки для щелочи при осторожном покачивании колбы Къельдаля, приливают избыток щелочи, при этом цвет раствора должен резко измениться - от прозрачного до синего или бурого. Открывают зажим на отводящей пар трубке в колбу Къельдаля и закрывают остальные краны, при этом пар будет проходить через жидкость в колбе Къельдаля и увлекать аммиак. В холодильнике пар конденсируется. Раствор аммиака попадает в колбу с 0,1 н. раствором серной кислоты. При нормальном кипении объем раствора в приемной колбе через 20 - 30 мин обычно составляет 150 - 180 см³. Конец отгонки можно установить с помощью красной лакмусовой бумажки. Для этого приемную колбу отставляют от аппарата, предварительно обмыв конец холодильника дистиллированной водой, и подставляют лакмусовую бумажку под стекающие капли дистиллята. Если лакмус не синеет, отгон аммиака закончен. Если лакмус синеет, приемную колбу снова подставляют под холодильник и продолжают отгонку. После окончания отгонки приемную колбу опускают, и конец холодильника обмывают дистиллированной водой в приемную колбы. После этого открывают краны на воронке бачка-парообразователя и воронке для щелочи и закрывают зажим, отводящий пар трубки в колбу Къельдаля. Содержимое приемной колбы титруют 0,1 моль/дм³ раствором гидроокиси натрия до перехода окраски в зеленую.

Необходимо параллельно с определением азота в исследуемой пробе проводить определение азота в реактивах («холостой опыт») для внесения соответствующей поправки в результат анализа. Определение азота в реактивах следует повторять каждый раз после замены партии серной кислоты, катализатора или титрованных растворов. Допускается отгонка аммиака (особенно в случае применения больших колб для сжигания) без использования пара непосредственно нагревом колбы на электрическом нагревателе. Проведение отгонки аммиака и все последующие операции проводятся так же, как и с применением пара.

Способ 3

Определение содержания азота проводят на автоматическом анализаторе типа «Къельдек», фирма Текатор, Швеция в соответствие с инструкцией к прибору.

Обработка результатов

Массовую долю азота (X) в испытуемой пробе в процентах от ее массы при проведении отгонки аммиака в борную кислоту вычисляют по формуле

, где

V₁ - объем раствора серной кислоты, израсходованный на титрование испытуемого раствора, см³;

V₀ - объем раствора серной кислоты, израсходованный на титрование в контрольном опыте, см³;

K - поправка к титру 0,05 ммоль/дм³ раствора серной кислоты, если он приготовлен не из стандарт-титра;

0,0014 - количество азота, эквивалентное 1 см³ раствора серной кислоты, г;

М - масса навески, г.

Массовую долю азота (X) в испытуемой пробе в процентах от ее массы при отгонке аммиака в серную кислоту вычисляют по формуле:

, где

V₀ - объем 0,1 моль/дм³ раствора гидроокиси натрия, израсходованный на титрование 0,05 моль/дм³ серной кислоты в контрольном опыте, см³

V₁ - объем 0,1 моль/дм³ раствора гидроокиси натрия, израсходованный на титрование серной кислоты в испытуемом растворе, см³;

K - поправка к титру 0,1 моль/дм³ раствора гидроокиси натрия;

0,0014 - количество азота, эквивалентное 1 см³ 0,05 моль/дм³ раствора серной кислоты;

М - масса навески, г.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных испытаний. Результаты вычисляют до третьего десятичного знака и округляют до второго десятичного знака.

Расчет содержания общего азота в пробе при использовании автоматического анализатора (способ 3) проводят в соответствии с инструкцией к прибору.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение между двумя параллельными определениями (r) не должно превышать значений, вычисляемых по формуле:

r = 0,03 + 0,02×X₁, но не более 0,1 % абсолютного содержания общего азота, где

X₁ - среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R) должно превышать значений, вычисляемых по формуле:

R = 0,04 + 0,045×Х₂, но не более 0,2 % абсолютного содержания общего азота, где

Х₂ - среднее арифметическое результатов двух испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, %.

Массовую долю азота в пересчете на сухое вещество продукта (Х₃), в процентах, вычисляют по формуле:

, где

X₁ - массовая доля азота в испытуемой пробе, %;

W - влажность испытуемой пробы, %.

Массовую долю белка (Y) в процентах вычисляют по формуле:

Y = К´Х₁, Х₂ или Х₃, где

К - коэффициент пересчета азота на белок БАД:

с высоким (более 15 %) содержанием липидов - 6,25;

с умеренным (2 - 15 %) содержанием липидов - 6,38;

с низким содержанием липидов - 5,70.

2. Определение аминокислотного состава

Сущность метода заключается в гидролизе образца до аминокислот и последующем количественном определении образовавшихся аминокислот на аминокислотном анализаторе.

Подготовка к испытанию

В пробе определяют общий белок, содержание липидов и влажность по методикам, описанным в настоящем руководстве.

Для жидких БАД учитывают содержащуюся воду в процессе приготовления гидролизующей смеси таким образом, чтобы концентрация соляной кислоты была 6М. При содержании липидов более 5 % проводят обезжиривание способом, указанным в табл. 1. После обезжиривания остаток подсушивают на воздухе и определяют содержание общего белка. Рассчитывают величину навески образца для гидролиза, исходя из соотношения белка к кислоте, представленных в табл. 1, и при условии содержания белка в пробе не менее 5 мг.

Проведение испытания

Три навески БАД или обезжиренного остатка, подготовленных к гидролизу в соответствии с разделом 1, взятых с точностью 0,0001 г, помещают в стеклянную ампулу с оттянутым концом, заливают расчетным количеством соляной кислоты (в случае жидких БАД берут расчетное количество концентрированной кислоты и доводят до концентрации 6М).

Ампулы запаивают, устанавливают в строго вертикальном положении в металлический патрон или фарфоровый стакан с парафином и помещают в сушильный шкаф с заранее отрегулированной температурой 110±2 °С. Нагревание проводят непрерывно в течение 24, 48 и 72 ч. Затем ампулы охлаждают до комнатной температуры. Необходимость трех временных отрезков гидролиза объясняется различиями в скорости отщепления отдельных аминокислот. На основании результатов последующих анализов содержания аминокислот за каждое время гидролиза строят кривую и методом интерполяции или экстраполяции до нулевого времени находят максимальную величину.

Каждую ампулу вскрывают и сразу приступают к удалению соляной кислоты. Если в гидролизате образовался видимый осадок, его удаляют центрифугированием или фильтрованием с последующим доведением фильтрата в мерной колбе до 25 см³ до точного объема. В случае конечного объема больше 5 см³ и при использовании высокочувствительных приборов для удаления соляной кислоты берут аликвоту.

Удаление соляной кислоты проводят одним из следующих способов:

а) помещают ампулу или пробирку в вакуум-эксикатор над гранулированным гидратом окиси натрия (NaOH) на 12 - 18 ч;

б) на роторном испарителе при температуре не выше 60 °С. Для этого гидролизат количественно переносят в грушевидную колбу, ополаскивая ампулу дистиллированной водой.

Таблица 1

Условия подготовки проб к анализу для БАД, содержащих различные уровни липидов

Остаток переносят количественно в мерную колбу с помощью нитратного буфера рН 2,2 или раствора соляной кислоты 0,02 М и доводят до метки. Полученный раствор гидролизата подвергают анализу на аминокислотном анализаторе в соответствии с инструкцией прибору.

В случае, если анализ не может быть проведен немедленно, осадок освобождают от следов соляной кислоты путем добавления к нему дистиллированной воды и повторного испарения на роторном испарителе или в вакуумном эксикаторе. Операцию повторяют до полного исчезновения запаха соляной кислоты.

Хранят образец в морозильной камере или нижней камере холодильника при температуре не выше 5 °С, перед анализом разводят цитратным буфером до необходимой концентрации. Обнаруженный осадок отфильтровывают через плотный фильтр.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытания, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) для основных аминокислот при концентрациях, характерных для трех важнейших групп продуктов, приведены в табл. 2.

Таблица 2

Допустимые относительные внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения результатов определения содержания аминокислот в основных группах БАД

II. Методы определения липидов

1. Методы определения содержания жира в БАД на растительной и жировой основе

1.1. Гравиметрический метод

Метод основан на извлечении сырого жира из БАД растворителем, последующем удалении растворителя, высушивании и взвешивании извлеченного жира.

Подготовка проб к испытанию

Перед началом определений продукт, отобранный из средней пробы по ГОСТ 26312.1-84, тщательно перемешивают, отбирают навеску массой 50 г и измельчают на мельнице.

Приготовление патрона из фильтровальной бумаги

Для приготовления патрона фильтровальную бумагу обезжиривают следующим образом. Листы фильтровальной бумаги свертывают в трубку и помещают в цилиндр с пришлифованной пробкой так, чтобы вся бумага поместилась в цилиндре. В цилиндр перед помещением бумаги наливают 100 - 200 см³ диэтилового эфира или гексана. После того как растворитель поднимется по бумаге до его верхнего края, цилиндр открывают, бумагу вынимают и дают растворителю испариться, затем ножницами от верхнего края отрезают полоску шириной 4 - 5 см, а остальную часть бумаги используют для приготовления патронов. Вату обезжиривают также в цилиндре. Обезжиренную вату и бумагу хранят в закрытой посуде. Обезжиренный прямоугольный кусок бумаги навертывают на деревянную болванку. По мере навертывания свободный край бумаги подворачивают складками для образования донышка патрона. Бумагу и болванку берут таким образом, чтобы стенки патрона получились двойными, а его диаметр был на 0,5 см меньше диаметра экстрактора. На дно патрона кладут кусочек обезжиренной ваты.

Проведение испытания

В патрон из фильтровальной бумаги отвешивают 1 - 5 г испытуемой пробы, с погрешностью не более 0,01 г, сверху кладут кусочек обезжиренной ваты. Приготовленный таким образом патрон помещают в экстрактор аппарата Сокслета так, чтобы он не был выше верхнего изгиба трубки. Колбу аппарата Сокслета высушивают при температуре 105±5 °С в течение 2 ч и после охлаждения взвешивают. Колбу наполняют примерно на  объема гексаном или диэтиловым эфиром и присоединяют к экстрактору. Пускают воду в холодильник и колбу с растворителем нагревают на водяной или песочной бане. При этом растворитель, находящийся в колбе, испаряется и в виде паров проходит через широкую трубку экстрактора в холодильник, где охлаждается и в виде капель поступает в экстрактор с патроном. При заполнении экстрактора растворителем до верхнего изгиба сифонной трубки последний переливается в колбу, унося с собой жир. В течение 1 ч должно быть 7 - 9 сливов растворителя. Экстракцию ведут 2 ч. Затем патрон удаляют из экстрактора и отгоняют растворитель из колбы в экстрактор. После заполнения экстрактора до верхнего изгиба сифонной трубки чистый растворитель сливают из экстрактора, который затем вновь присоединяют к аппарату Сокслета, и отгоняют оставшийся в колбе растворитель. По окончании отгонки растворителя отсоединяют экстрактор, колбу выдерживают на бане до испарения растворителя. После испарения растворителя колбу помещают в сушильный шкаф и высушивают при температуре 105 ± 5 °С в течение 60 мин, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Последующее взвешивание проводят после повторной сушки в течение 30 мин. Высушивание и взвешивание повторяют до тех пор, пока разность результатов двух последовательных взвешиваний будет не более 0,001 г. Одновременно определяют влажность.

Обработка результатов

Массовую долю сырого жира в процентах, в пересчете на сухое вещество, в испытуемой пробе (X) вычисляют по формуле:

, где

М - масса пробы, г;

m₁ - масса пустой колбы, г;

m₂ - масса колбы с жиром, г;

W - массовая доля влаги в испытуемой пробе, %.

За окончательный результат определения принимают среднее арифметическое результатов (Х₁) двух параллельных определений. Вычисления проводят с точностью до 0,1 %.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

r = 0,02 + 0,02×Х₁, но не более 0,4 % абсолютного содержания жира, где

X₁ - среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

R = 0,04 + 0,035×Х₂, но не более 0,8 % абсолютного содержания жира, где

Х₂ - среднее арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных лабораториях, %.

1.2. Определение содержания жира в БАД на зерновой основе

Для определения массовой доли жира в БАД на зерновой основе используют три варианта метода:

а) экстракционный метод с предварительным гидролизом навески;

б) рефрактометрический;

в) бутирометрический.

А. Экстракционный метод с предварительным гидролизом навески

Метод основан на извлечении жира из предварительно гидролизованной навески изделия растворителем и определении количества жира взвешиванием после удаления растворителя из определенного объема полученного раствора.

Проведение испытания

Навеску продукта в 1 - 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,05 г, помещают в плоскодонную колбу вместимостью 300 см³, приливают 100 см³ 1,5 % соляной кислоты (или 10 см³ 5 % серной кислоты), кипятят в колбе с обратным холодильником на кипящей бане 30 мин. Затем колбу охлаждают водой до комнатной температуры, приливают в колбу 50 см³ хлороформа, плотно закрывают хорошо пригнанной пробкой, энергично взбалтывают в течение 15 мин, затем выливают содержимое в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 2 - 3 мин при 3000 об/мин.

В пробирке образуются три слоя. Верхний водный слой отбирают пипеткой. Пипеткой, снабженной резиновой грушей, отбирают хлороформенный раствор жира и фильтруют его в сухую колбу через небольшой ватный тампон, вложенный в узкую часть воронки, причем кончик пипетки должен при этом касаться ваты.

Фильтрат 20 см³ помещают в предварительно доведенную до постоянной массы и взвешенную на аналитических весах колбу вместимостью 100 см³.

Отбор и фильтрация должны производиться в течение 2 мин.

Хлороформ из колбы отгоняют на горячей водяной бане, пользуясь холодильником. Оставшийся в колбе жир сушат до постоянной массы (обычно 1 - 1,5 ч) при температуре 100 - 105 °С, охлаждают в эксикаторе в течение 20 мин и взвешивают колбу на аналитических весах.

Допускается также следующий способ расслаивания.

После гидролиза в охлажденную колбу добавляют 5 см³ раствора аммиака, 50 см³ хлороформа, затем содержимое колбы взбалтывают в течение 15 мин и оставляют на 1 ч для отстаивания. За это время полностью отделяется и четко виден нижний хлороформный слой.

Если расслаивания не произойдет, добавляют еще 2 - 3 см³ аммиака, следя за тем, чтобы реакция по фенолфталеину оставалась кислой.

После расслаивания отбор, фильтрацию, отгон хлороформного слоя и высушивание жира ведут как описано выше.

Примечания.

1. Отгон и фильтрацию растворителя проводят под вытяжкой.

2. При отсутствии хлороформа допускается применение дихлорэтана, который следует хранить в темных склянках.

Обработка результатов

Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле:

, где

М - масса колбы с высушенным жиром, г;

m₁ - масса пустой колбы, г;

50 - объем хлороформа, взятого для растворения жира, см³;

m₂ - масса навески исследуемого изделия, г;

20 - объем хлороформного раствора жира, взятого для отгона, см³;

W - массовая доля влаги в испытуемом изделии, %.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое (Х₁) результатов двух параллельных определений. Вычисления проводят с точностью до 0,1 %.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

r = 0,02 + 0,02×X₁, но не более 0,4 % абсолютного содержания жира, где

X₁ - среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

R = 0,04 + 0,035×Х₂, но не более 0,8 % абсолютного содержания жира, где

Х₂ - среднее арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных лабораториях, %.

Б. Рефрактометрический метод

Метод основан на извлечении жира из навески образца ά-бромнафталином или ά-хлорнафталином. Массовую долю жира в образце определяют по разности коэффициентов преломления растворителя и раствора жира в растворителе.

Подготовка к испытанию

Определение коэффициента преломления растворителей. Определяют коэффициент преломления ά-бромнафталина или ά-хлорнафталина при температуре 20 °С, нанося 1 - 2 капли этих растворителей на призму рефрактометра.

Определение плотности растворителей

Плотность растворителей (r, г/см³ при 20 °С) определяют пикнометром и вычисляют по формуле:

, где

Q - водное число пикнометра, г;

М - масса растворителя, г.

Взвешивание проводят с погрешностью не более 0,0002 г. Расхождение между параллельными взвешиваниями должно быть не более 0,0005 г.

Калибровка пипеток. Микропипетки калибруют по растворителю, отмеривая ими соответствующий объем растворителя и взвешивая его в стаканчике с погрешностью не более 0,0002 г. Расхождение между параллельными взвешиваниями должно быть не более 0,0005 г.

Из трех взвешиваний берут среднее арифметическое и вычисляют объем пипетки (V) в см³ по формуле:

, где

М - масса растворителя, соответствующая объему взятой пипетки, г;

r - плотность растворителя при температуре 20 °С.

Проведение испытания

При анализе взвешивают 2 г БАД с точностью до 0,05 г и помещают в фарфоровую ступку. Затем калиброванной пипеткой приливают 4 см³ растворителя. Содержимое ступки энергично растирают в течение 3 мин. Смесь переносят из ступки на маленький складчатый фильтр. Первые 2 - 3 капли фильтрата отбрасывают, а последующий фильтрат в количестве 2 - 3 капель помещают на призму рефрактометра и определяют коэффициент преломления.

При анализе изделий с низкой влажностью перед добавлением песка измельченную навеску смачивают 1 см³ воды. Охладив массу, приливают точно 4 - 6 см³ растворителя и вновь все растирают в течение 3 мин, затем добавляют 2 г безводного углекислого натрия, перемешивают, смесь из ступки переносят на складчатый фильтр и фильтруют в стаканчик.

Из полученного фильтрата наносят 2 - 3 капли на призму рефрактометра и определяют коэффициент преломления.

Определение коэффициента преломления проводят при 20±0,2 °С или любой комнатной температуре.

В последнем случае показатель преломления раствора приводят к температуре 20 °С путем внесения поправки по табл. 3.

Отсчет показателя преломления раствора жира можно также производить при любой комнатной температуре без учета поправки на температуру при условии одновременного определения показателя преломления растворителя при той же температуре.

Обработка результатов

Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле:

, где

V_p - объем растворителя, взятого для извлечения жира, см³;

ж - относительная плотность жира при 20 °С;

П_р - коэффициент преломления растворителя;

П_рж - коэффициент преломления раствора жира в растворителе;

П_ж - коэффициент преломления жира;

М - масса изделия, г;

W - влажность изделия, %.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое (X₁) двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

r = 0,03 + 0,035×X₁, но не более 0,6 % абсолютного содержания жира, где

X₁ - среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Таблица 3

Температурные поправки при определении показателей преломления раствора жира в ά-бромнафталине

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R) не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

R = 0,04 + 0,06×Х₂, но не более 1,2 % абсолютного содержания жира, где

Х₂ - среднее арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных лабораториях, %.

При вычислении процентного содержания жира пользуются показателями преломления и плотности жиров, указанными в табл. 4.

Таблица 4

Коэффициенты преломления жиров

Примечания

1. Если в исследуемом образце находится неизвестный жир или имеется смесь жиров, поступают следующим образом: 1 - 5 г измельченного изделия заливают трехкратным количеством растворителя (хлороформа, тетрахлоруглерода и др.), взбалтывают в течение 15 мин, вытяжку фильтруют в колбочку, растворитель полностью отгоняют, остаток подсушивают и определяют коэффициент преломления смеси жиров или неизвестного жира.

2. Для смеси жиров или неизвестного жира плотность принимается равной 0,920.

3. При хорошем растирании навески с растворителем в ступке, когда смесь перенесена на фильтр, разрешается стекающие из воронки капли раствора жира и растворитель наносить на призму рефрактометра, не дожидаясь, пока профильтруется вся смесь.

4. Вся работа с органическими растворителями проводится в вытяжном шкафу или хорошо вентилируемой камере.

В. Бутирометрический метод

Метод основан на растворении исследуемой навески в 60 %-ной серной кислоте и отделении слоя жира в молочном бутирометре центрифугированием в присутствии изоамилового спирта, который образует с серной кислотой изоамилово-серный эфир, уменьшающий величину поверхностного натяжения жировых шариков и способствующий слипанию их в единый жировой слой.

Объем выделившегося жира измеряют в градуированной части бутирометра.

Проведение испытания

Из средней пробы готовых образцов отбирают по две навески массой по 2 г каждая. Навески помещают в фарфоровые стаканчики и заливают 9 см³ 60 %-ной серной кислоты.

Стаканчики погружают в водяную баню с температурой воды 80 °С и производят растворение навески в серной кислоте в течение 20 мин при периодическом перемешивании стеклянной палочкой.

После растворения навески темную жидкость переносят в молочные бутирометры, смывая остатки из стаканчика с помощью 10 см³ 60 % серной кислоты.

В бутирометры осторожно (чтобы не замочить горлышко) приливают по 1 см³ изоамилового спирта, плотно закрывают резиновыми пробками, плавно перемешивают в течение 3 мин и помещают в гнезда водяной бани с температурой воды 80 °С на 5 мин (пробками вниз).

По истечении 5 мин бутирометры вынимают из водяной бани, размещают в молочной центрифуге (пробками к периферии) и центрифугируют 5 мин. После центрифугирования бутирометры снова помещают на 5 мин в водяную баню с температурой воды 80 °С (пробками вниз), после чего вынимают и отмечают высоту желтого жирового слоя над темной жидкостью по числу малых делений градуированной части бутирометра.

Обработка результатов

Массовую долю жира (X) в процентах в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле:

, где

N - высота жирового слоя в бутирометре по числу малых делений;

0,01133 - количество жира, соответствующее одному малому делению бутирометра, г;

W - влажность, %;

Q - навеска изделия, г.

Для удобства и ускорения расчета можно использовать данные табл. 5.

Для дальнейшего пересчета на сухое вещество умножают массовую долю жира в процентах, найденную по таблице, на 100 и делят на разность (100 - W). За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое (X₁) результатов двух параллельных определений.

Таблица 5

Показания бутирометра в зависимости от содержания жира

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

r = 0,02 + 0,02×X₁, но не более 0,4 % абсолютного содержания жира, где

X₁ - среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

R = 0,04 + 0,04×X₂, но не более 0,8 % абсолютного содержания жира, где

Х₂ - среднее арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных лабораториях, %.

1.3. Определение массовой доли жира в БАД с высоким содержанием жира методом экстракции в аппарате Сокслета

Метод предназначен для определения массовой доли жира в БАД с высоким содержанием жира при проведении исследований и арбитражного анализа.

Диапазон измеряемых концентраций от 40 до 85 %.

Метод основан на экстракции растворителем в аппарате Сокслета.

Подготовка к испытанию

Гигроскопическую вату и фильтровальную бумагу помещают в аппарат Сокслета и экстрагируют этиловым эфиром в течение 2 - 3 ч.

Подготовка экстракционных патронов

Патроны для экстракционных насадок типа НЭТ готовят как указано выше.

Подготовка БАД к экстракции

В фарфоровую ступку взвешивают по разности 5 г БАД с записью значения массы до четвертого десятичного знака. Смешивают с 15 г прокаленного сульфата натрия и переносят в подготовленный экстракционный патрон, после чего ступку и шпатель с помощью пинцета протирают несколько раз ватой, сначала сухой, а затем смоченной этиловым эфиром. Всю вату помещают в тот же патрон. Сверху кладут небольшой слой ваты, затем края патрона завертывают.

Экстракция жира

Патрон с навеской БАД помещают в экстрактор. К экстрактору присоединяют чистую колбу, предварительно высушенную в течение 1 ч при 100 - 105 °С и взвешенную после охлаждения. Через холодильник при помощи воронки наливают в экстрактор этиловый эфир так, чтобы патрон в экстракторе был полностью покрыт слоем эфира. В колбу наливают также эфир на  ее объема.

Колбу собранного аппарата нагревают на закрытой водяной бане, обеспечивающей равномерное, не слишком сильное кипение эфира. Через 3 ч проверяют полноту экстракции. Для этого, охладив колбу, отсоединяют ее на мгновение от остальной части прибора и 1 - 2 капли эфира с нижнего конца сифона экстрактора наносят на чистое часовое стекло или кусочек фильтровальной бумаги. Экстракцию считают законченной, если после испарения эфира не остается масляных пятен на стекле или бумаге.

По окончании аппарат разбирают, вынимают патрон из экстрактора, последний присоединяют снова к колбе и отгоняют растворитель на водяной бане. Колбу сушат с жиром в сушильном шкафу в течение 1 ч при температуре 100 - 105 °С. Колбу взвешивают после охлаждения ее в эксикаторе. Последующие взвешивания производят через каждые 15 мин сушки. Масса считается постоянной, если отличается от предыдущей не более чем на 0,0004 г.

Расчет результата определения

Массовую долю жира в БАД в % (Х) вычисляют по формуле:

, где

М₁ - масса колбы с высушенным жиром, г;

М₂ - масса пустой колбы, г;

М - навеска БАД, г.

Конечным результатом считают среднее арифметическое двух параллельных определений (Х₁) отдельных проб БАД. Вычисления проводят до второго десятичного знака.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение двух параллельных определений (r) не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

r = 0,02 + 0,01×X₁, но не более 0,4 % абсолютного содержания жира, где

X₁ - среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, %.

Допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R), не должно превышать значений, рассчитанных по формуле:

R = 0,04 + 0,02×X₂, но не более 0,8 % абсолютного содержания жира, где

Х₂ - среднее арифметическое результатов анализов, выполненных в двух разных лабораториях, %.

2. Методы определения жирнокислотного состава

Метод основан на разделении метиловых эфиров жирных кислот, полученных из липидов БАД, с помощью газожидкостной хроматографии.

Выделение липидов из БАД

Липиды выделяют экстракционным методом, предложенным для данной группы БАД, исключающим термическое воздействие на объект и изложенным в вышеприведенных разделах.

Получение метиловых эфиров жирных кислот

Метанолиз в щелочной среде нейтральных масел и жиров проводят по ГОСТ 30418-96 «Масла растительные. Метод определения жирнокислотного состава». Получение метиловых эфиров жирных кислот может быть проведено метанолизом в кислой среде или переэтерификацией липидов метенолом в среде хлористого водорода по ГОСТ Р 51486-99 «Масла растительные и жиры животные. Получение метиловых эфиров жирных кислот».

Для определения абсолютных количеств жирных кислот проводится анализ с применением внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта используют маргариновую кислоту или дибутилфталат.

Анализ метиловых эфиров жирных кислот методом ГЖХ

Метод основан на использовании газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) метиловых эфиров жирных кислот по ГОСТ Р 51483-99 «Масла растительные и жиры животные. Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров индивидуальных жирных кислот к их сумме». Результаты выражают в массовых долях каждого индивидуального компонента БАД.

Эталонный стандарт - смесь метиловых эфиров известного состава, желательно, аналогичного составу анализируемого вещества.

Идентификацию пиков метиловых эфиров жирных кислот проводят по относительным приведенным временам удерживания или эквивалентным длинам цепи (ЭДЦ).

В качестве неподвижных жидких фаз используют полиэфиры типа полиэтиленгликольадипат, полипропиленгликольадипат, диэтиленгликольсукцинат, цианосиликоны (SP-100, FFAP, силары OV-275, Sil-88) или другие жидкости, дающие необходимое хроматографическое разделение.

Комментарий к условиям анализа

Температура термостата колонок:

а) при анализе смесей метиловых эфиров жирных кислот с длиной цепи более 14 углеродных атомов 170 - 190 °С (изотермический режим). Условия подбирают таким образом, чтобы метилолеат выходил из колонки за 15 мин;

б) при анализе смесей метиловых эфиров, содержащих низкомолекулярные компоненты, температуру термостата программируют в пределах от 120 до 195 °С со скоростью 6 - 8 °С в 1 мин (при наличии метилового эфира масляной кислоты начальная температура программирования 70 °С).

Величина вводимой пробы - около 1 - 2 мкл раствора метиловых эфиров в гексане для набивных колонок и 0,2 - 0,3 мкл - для капиллярных.

В случае необходимости рекомендуется производить анализ на двух зафиксированных фазах с различными полярностями с целью проверки отсутствия скрытых пиков (для рыбьего жира или в случае одновременного присутствия С18:3, С20:0, С20:1).

Обработка результатов

Качественный анализ

Анализируют эталонную смесь метиловых эфиров. Строят график зависимости логарифма времени удерживания от числа углеродных атомов в цепи. Получают ряд параллельных прямых для насыщенных, моно-, ди- и т.д. ненасыщенных метиловых эфиров кислот или находят величины эквивалентной длины цепи ЭДЦ для ненасыщенных и разветвленных жирных кислот по формуле:

, где

n - число атомов углерода в насыщенной кислоте нормального строения, находящейся на хроматограмме перед неизвестным компонентом;

lgV_n - логарифм времени удерживания кислоты с n-числом атомов углерода;

lgV_n+1 - логарифм времени удерживания кислоты с n+1-числом атомов углерода;

lgV_x - логарифм времени удерживания неизвестного компонента.

Идентифицируют пики на хроматограмме анализируемой смеси по полученному графику или по величинам ЭДЦ. Следует избегать условий анализа, при которых происходит наложение пиков метиловых эфиров различных кислот (например, метиллинолената и метиларахината).

Количественный анализ и способы расчета

За исключением специальных анализов расчет проводят методом внутренней нормализации, когда все компоненты смеси представлены на хроматограмме и площадь всех пиков компонентов составляет 100 %. При наличии интегратора пользуются полученными с его помощью цифрами. При отсутствии интегратора площади пиков измеряют, умножая высоту пика на его ширину (или ширину пика на половине его высоты), и учитывая переключения чувствительности усилителя, используемые во время записи хроматограммы.

Расчет без использования поправочных коэффициентов

Расчет массовой доли i-го компонента в % проводят по формуле:

, где

С - массовая доля i-го компонента;

S_i - площадь пика i-го компонента;

 - сумма всех площадей пиков.

За результат анализа принимают среднее арифметическое (X₁) из двух параллельных измерений.

Расчет с использованием поправочных коэффициентов

В случае, когда в анализируемой смеси присутствуют кислоты с 12 и менее углеродными атомами в цепи, расчет ведется с применением поправочных коэффициентов.

Поправочные коэффициенты (К_i) рассчитывают по хроматограммам эталонных смесей известного состава, полученным в условиях, применяемых для анализа образца по формуле:

, где

M_i - масса i-го компонента в эталонной смеси, г;

 - масса эталонной смеси, г.

Часто используют относительные поправочные коэффициенты () по отношению к поправочному коэффициенту метилпальмитата ():

.

Массовую долю i-го компонента анализируемой смеси определяют по формуле:

.

За результат анализа принимают среднее арифметическое из двух параллельных измерений с записью до первого десятичного знака.

Расчет с применением внутреннего стандарта

В случаях, когда не все компоненты в анализируемой смеси элюируются из колонки или присутствуют очень летучие компоненты, используют для расчета метод внутреннего стандарта.

В качестве внутреннего стандарта применяют метиловые эфиры кислот, отсутствующие в анализируемой смеси. При анализе проб, содержащих масляную кислоту, в качестве внутреннего стандарта используют валериановую кислоту, в остальных случаях - пентадекановую или маргариновую кислоту. Массовую долю i-го компонента пробы определяют по формуле:

, где

т - содержание липидов в продукте, мг в 100 г;

M_s - масса внутреннего стандарта, мг;

М - масса образца, мг;

K_s - поправочный коэффициент внутреннего стандарта;

S_s - площадь пика внутреннего стандарта.

Метрологические характеристики

Допустимые расхождения содержания жирных кислот в продукте рассчитывают (в %) по следующим формулам:

r = 0,225 + 0,04 Х₁, но не более 1 % абсолютного содержания кислоты,

R = 0,310 + 0,075×Х₂, но не более 3 % абсолютного содержания кислоты.

3. Методы определения стеринов

3.1. Колориметрический метод определения содержания стеринов после омыления проб

Метод основан на колориметрической реакции стеринов, извлекаемых диэтиловым эфиром из омыленных проб растительных масел, с уксусным ангидридом в присутствии концентрированной серной кислоты.

Условия проведения анализа

Экстракцию неомыленных веществ следует проводить по возможности быстро, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

Отгонку диэтилового эфира из проб следует проводить под вакуумом водоструйного насоса при комнатной температуре.

Подготовка к проведению анализа

Приготовление и очистка реактивов

Безводный сернокислый натрий прокаливают в течение 1 - 1,5 ч при температуре 110 °С. Диэтиловый эфир обрабатывают марганцовокислым калием (5 г на л) и гидратом окиси калия (10 г на 1 дм³) в течение суток, а затем перегоняют. Этиловый спирт ректификованный технический освобождают от альдегидов. Начальную и конечную порции отгона отбрасывают. Хлороформ сушат в течение суток под хлористым кальцием и перегоняют.

Построение градуировочного графика

Градуировочный график строят на основании результатов анализа проб с известным содержанием чистого b-ситостерина.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ отвешивают 0,15 - 0,20 г b-ситостерина (с записью результата до 4-го знака после запятой). Навеску растворяют в 100 см³ хлороформа. Из полученного раствора готовят серию стандартных растворов с содержанием b-ситостерина 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,12; 0,14; 0,16; 0,18; 0,20 г/дм³. Из каждого раствора отбирают пипеткой 3 см³, добавляют 2 см³ уксусного ангидрида и 6 капель серной кислоты. Через 10 мин после добавления кислоты измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 690 нм. В качестве контроля служит раствор, состоящий из 3 см³ хлороформа, 2 см³ уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной кислоты.

Градуировочный график строят в координатах: оптическая плотность (D) - концентрация стандартных растворов b-ситостерина. Градуировочный график строят для каждого спектрофотометра и проверяют при смене партий путем определения оптической плотности стандартных растворов двух разных концентраций.

Проведение анализа

Испытуемый образец (1 - 3 г) взвешивают в колбе вместимостью 100 см³ (с записью результата взвешивания до 4-го знака после запятой), добавляют 0,1 - 0,3 г аскорбиновой кислоты и 10 - 30 см³ свежеприготовленного 2 н. спиртового раствора КОН. Смесь нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 мин.

Содержимое колбы охлаждают и количественно переносят в делительную воронку с 30 - 90 см³ дистиллированной воды. Неомыляемые вещества экстрагируют диэтиловым эфиром 3 - 4 раза порциями по 20 - 60 см³. Объединенный эфирный экстракт промывают в делительной воронке дистиллированной водой до нейтральной реакции промывной воды по фенолфталеину. Промытую эфирную вытяжку помещают в коническую колбу, засыпают 5 - 10 г безводного сульфата натрия и оставляют в темном месте на 30 мин, периодически взбалтывая. Затем содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в другую колбу, фильтр ополаскивают эфиром. Эфир отгоняют под вакуумом при температуре не выше 25 - 30 °С.

Остаток в колбе после отгонки эфира растворяют в зависимости от навески исследуемого образца в 1 - 3 см³ бензола. Затем производят разделение компонентов смеси неомыляемых веществ методом тонкослойной хроматографии. Для этого на пластинку «Силуфол» наносят 50 - 150 мкл бензольного раствора неомыляемых веществ в виде полоски, отстоящей на 2 см от нижнего и боковых краев пластинки.

На одном уровне с пробой на расстоянии 1 см от краев пластинки наносят по капле раствор b-ситостерина. Пластинку помещают вертикально в хроматографическую камеру, в которую заранее наливают смесь диэтилового и петролейного эфиров, взятых в соотношении 1:1. Количество растворителя зависит от размеров хроматографической камеры и регулируется высотой его слоя, равной 1 см.

Развитие хроматограммы продолжается до тех пор, пока фронт растворителя не поднимается на 10 - 12 см. Обычно это занимает 10 - 12 мин. Затем пластинку вынимают из камеры и подсушивают на воздухе до исчезновения запаха эфира. Края хроматограммы шириной 2 см опрыскивают 5 %-ным спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты, после чего пластинки помещают на 1 - 5 мин (до проявления) в термостат с температурой около 90 °С. На уровне окрашенного пятна свидетеля соскребают слой адсорбента. Адсорбент элюируют хлороформом 6 - 8 раз порциями по 1 см³. После каждого элюирования адсорбент отделяют центрифугированием или фильтрацией. Объединенный элюат собирают в градуированную пробирку и упаривают до объема 3 см³. К хлороформному раствору стеролов приливают 2 см³ уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной кислоты (по капле). Через 10 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 690 нм.

Контролем служит раствор, состоящий из 3 см³ хлороформа, 2 см³ уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной кислоты.

Обработка результатов

Массовую долю стеринов в пробе (X, %) рассчитывают по формуле:

, где

V - объем хлороформного раствора, взятого для проведения колориметрической реакции, см³;

V₁ - объем бензольного раствора неомыляемых веществ, см³;

V₂ - объем бензольного раствора неомыляемых веществ, нанесенный на пластинку, см³;

С - концентрация стеролов, определяемая по градуировочному графику, г/дм³;

М - масса образца, г.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое (X) результатов двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) приведены в табл. 6.

Таблица 6

Относительные допустимые внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения результатов определения

3.2. Определение состава стеринов методом ГЖХ

Метод основан на прямом газохроматографическом анализе стеринов, выделенных из липидов путем тонкослойной хроматографии фракции неомыляемых веществ.

Условия проведения анализа

Выделение липидов проводят одним из унифицированных методов, предложенным для данного продукта и исключающим разрушение стеринов.

Экстракцию неомыляемых веществ следует проводить по возможности быстро, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

Отгонку диэтилового эфира из проб следует проводить под вакуумом водоструйного насоса при комнатной температуре.

Подготовка к проведению анализа

Подготовку проводят по п. «Колориметрический метод определения содержания стеринов».

Проведение анализа

Выделение стеролов из липидов

Омыление липидов, экстракцию неомыляемых веществ, выделение стеринов методом тонкослойной хроматографии проводят по п. «Колориметрический метод определения содержания стеринов».

Газохроматографический анализ

Аппаратура, используемая для проведения анализа, выбор оптимальных условий для разделения стеринов, определение эффективности хроматографических колонок изложены в п. выше.

Устанавливают следующие условия анализа на хроматографе: стеклянная или стальная колонка длиной 1,5 - 2,0 м и внутренним диаметром 3 - 4 мм, заполненная силанизированным целитом 545 (60 - 100 меш), обработанным 3 % полиметилсилоксаном SE-30 или аналогичной неподвижной фазой. Скорость потока газа-носителя 60 - 100 см³/мин. Температура термостата колонки 250 - 270 °С, инжектора 300 °С, детекторов 280 °С.

Вводят в хроматограф около 3 мкл каждого компонента.

Обработка результатов

Рассчитывают площади пиков каждого компонента (S_i) по формуле:

S_i = K_i´D_i´H_i, где

D_i - ширина i-го пика на половине его высоты, мм;

H_i - высота i-го пика, мм;

K_i - поправочный коэффициент.

Для получения поправочных коэффициентов составляют 3 - 4 стандартные смеси стеролов, входящих в исследуемые образцы, и холестерола. По хроматограммам стандартных смесей, полученных в идентичных условиях, определяют поправочные коэффициенты по отношению к холестеролу, коэффициент которого принят за единицу, по формуле:

, где

m_i и М_ст - масса i-го компонента и стандарта (холестерина);

S_i и S_ст - площади их пиков соответственно.

Молярную долю каждого стерина (С_i) рассчитывают методом нормализации по формуле, принимая сумму площадей всех типов за 100 %:

, где

 - площадь пика i-го компонента;

 - сумма площадей пиков стеринов.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое (X) результатов двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории по отношению к среднему арифметическому значению (Rr), и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненное в двух разных лабораториях по отношению к среднему арифметическому значению (RR) приведены в табл. 7.

Таблица 7

Относительные допустимые внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения результатов определения

3.3. Метод хромато-масс-спектрометрии в анализе стеринов

Метод основан на прямом хромато-масс-спектрометрическом анализе стеринов, выделенных из липидов путем тонкослойной хроматографии фракции неомыляемых веществ.

Условия проведения анализа

Выделение липидов проводят одним из унифицированных методов, предложенным для данного БАД и исключающим разрушение стеринов.

Экстракцию неомыляемых веществ следует проводить по возможности быстро, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света, отгонку растворителя следует проводить под вакуумом на ротационном испарителе при комнатной температуре.

Подготовку к проведению анализа и выделение стеринов из липидов проводят по п. «Колориметрический метод определения содержания стеринов».

Условия анализа: хромато-масс-спектрометр с автоматической системой обработки данных, энергия ионизирующих электронов 70 eV; диапазон массовых чисел 39 - 500 а.е.м.; температура источника ионов 120 °С; хроматографическое разделение на капиллярной колонке 47 м´0,3 мм с химически связанной фазой SE-30, начальная температура колонки 50 °С - 2 мин, 240 °С - 8 мин. с последующим программированием со скоростью 4 °С/мин до 300 °С и изотермой (30 мин), температура испарителя 280 °С, переходных линий 275 °С. Скорость газа-носителя гелия 1,3 см³/мин, в момент ввода пробы сброс перекрыт на 30 с, далее деление потока 1:60.

Структуру компонентов определяют путем сравнения полученных масс-спектров с имеющейся базой данных, а также по молекулярным и характеристическим осколочным ионам, выбор которых определяется эмпирическими корреляциями между масс-спектром и структурой изучаемых стеринов.

Таблица 8

Состав фракций стеринов, % отн., выделенных из ряда БАД на растительной основе и на основе морепродуктов, полученный с помощью метода хромато-масс-спектрометрии

4. Метод определения фосфолипидов (определение суммарного фосфора)

Метод основан на способности фосфора, соединяясь с молибденом аммония образовывать фосфорномолибденовую кислоту, которая восстанавливается амидоловым реагентом и дает голубое окрашивание.

Специфические приборы и реактивы

Спектрофотометр.

Молибдат аммония, 8,4 %-ный.

Амидоловый реагент, 1 %-ный, свежеприготовленный.

Спиртовой раствор фосфора, 1,097 г KН₂PО₄ растворяют в 250 см³ воды, этот запасной раствор разбавляют водой и получают рабочий раствор, содержащий 10 мкг фосфора в 1 см³.

Подготовка проб

Пипеткой отбирают аликвотную часть раствора липидов (содержащую 10 - 100 мкг фосфора, но не более 2 мг липидов) и переносят ее в толстостенную пирексовую пробирку с делениями, соответствующими 12,5 и 25 см³. Растворитель упаривают досуха в токе воздуха при 350 °С, к остатку прибавляют 2,0 хлорной кислоты, немного стеклянных шариков и нагревают пробирку на электрической плитке или газовой горелке до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и бесцветным. Охлажденный раствор разбавляют водой по 12,5 см³, тщательно перемешивают, добавляют 1,0 см³ раствора молибдата аммония, перемешивают и оставляют на 20 мин до появления голубой окраски.

Проведение испытания

Окрашенный раствор разбавляют водой по 25 см³, перемешивают. На спектрофотометре типа СФ-46 в парных кюветах 1 см определяют поглощение при 680 нм полученного раствора и р-ра холостого опыта.

Обработка результатов

Расчет производят по калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору KН₂PО₄. Используют аликвотные пробы стандартного раствора, содержащие от 30 до 60 мкг фосфора. Закон Бера соблюдается в интервале 10 - 100 мкг фосфора.

III. Методы определения углеводов

1. Определение содержания крахмала с помощью поляриметрического метода

Метод определения массовой доли крахмала в БАД на зерновой основе распространяется на продукты с массовой долей крахмала выше 10 %. Содержание крахмала определяют поляриметрическим методом путем его гидролиза раствором соляной кислоты.

Специфические аппаратура, материалы и реактивы

Сахариметр или поляриметр.

Мельница лабораторная, обеспечивающая требуемую крупность размола.

Сито из проволочной сетки № 08 по ТУ 14-4-1374-86.

Соляная кислота по ГОСТу 3118-77, раствор массовой концентрацией 11,24 г/дм³, для анализа картофеля - 3,77 г/дм³.

Калий железистосинеродистый по ГОСТу 4207-75, раствор массовой концентрацией 150 г/дм³.

Цинка сульфат по ГОСТу 3765-78, раствор массовой концентрацией 150 г/дм³.

Аммония молибдат по ГОСТу 3765-78, раствор массовой концентрацией 100 г/дм³.

Натрия молибдат по ГОСТу 10931-74, раствор массовой концентрацией 150 г/дм³.

Фосфорно-вольфрамовая кислота, раствор массовой концентрацией 40 г/дм³.

Подготовка к испытанию

Пробы, влажность которых превышает 17 %, предварительно подсушивают на воздухе или в одном из следующих устройств: сушильном шкафу, термостате, лабораторном сушильном аппарате при температуре воздуха не более 50 °С. Пробу тщательно перемешивают, измельчают до такой степени, чтобы весь размолотый материал прошел при просеивании через сито из проволочной сетки № 8.

Одновременно со взятием навесок для анализа берут навески для определения влажности. Определение влажности осуществляется по ГОСТам, принятым в соответствующей отрасли.

Проведение испытания

Из аналитической пробы берут навеску массой 5 г с погрешностью не более 0,01 г, помещают в 100 см³ центрифужный стакан, доливают 18 см³ 10 % раствора этанола (при определении массовой доли крахмала в отрубях - 28 см³ раствора этанола) и перемешивают стеклянной палочкой. Стеклянную палочку ополаскивают 2 см³ раствора этанола. Закрывают центрифужный стакан резиновой пробкой и вручную сильно встряхивают в течение 2 мин.

После встряхивания стенки центрифужного стакана и резиновую пробку ополаскивают 25 см³ этанола. Затем в течение 20 мин пробу центрифугируют при 4000 об/мин, после чего прозрачный центрифугат сливают. К остатку постепенно добавляют 20 см³ соляной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой до образования суспензии и переносят в мерную колбу на 100 см³. Прилипшие к стенкам центрифужного стакана и к стеклянной палочке остатки пробы многократно ополаскивают раствором соляной кислоты массовой концентрацией 11,24 г/дм³ в мерную колбу; общее количество раствора соляной кислоты составляет 50 см³.

Мерную колбу при постоянном встряхивании погружают в кипящую водяную баню. Из-за погружения мерной колбы не должен нарушаться процесс кипения водяной бани: с помощью специальных уплотнительных колец ее следует держать по возможности закрытой. По секундомеру встряхивают мерную колбу в течение 3 мин, при этом колбу из водяной бани не поднимают. После этого выдерживают колбу без встряхивания для всех крахмалосодержащих БАД 12 мин.

По истечении в общей сложности 15 мин для всех крахмалосодержащих БАД, колбу вынимают из бани и быстро приливают столько холодной воды, чтобы до мерной черты оставался объем не более 10 - 15 см³. Содержимое колбы охлаждают в проточной воде до температуры 20 °С.

Белковые вещества в растворе осаждают добавлением 2 см³ раствора калия железистосинеродистого (150 г/дм³) и после перемешивания 2 см³ раствора цинка сульфата (150 г/дм³). Затем мерную колбу в течение 10 - 15 мин выдерживают при комнатной температуре, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и в течение 5 мин дают отстояться. Взамен обоих указанных реактивов в случае их отсутствия для осаждения белков и осветления раствора в колбу приливают 5 см³ раствора аммония молибдата (100 г/дм³), или 5 см³ раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (40 г/дм³), или 3 см³ раствора натрия молибдата (165 г/дм³). При использовании молибдатов в качестве осадителей белков рекомендуется избегать попадания солнечных лучей на реактивы. Содержимое колбы через сухой складчатый фильтр фильтруют в сухую коническую колбу, первые несколько капель фильтрата отбрасывают. Прозрачным фильтром заполняют трубку поляриметра и в поляриметре измеряют оптическое вращение. Угол вращения испытуемого раствора в трубке поляриметра измеряют 5 раз.

До начала и после каждого второго измерения производят контроль установки поляриметра на нуль. Средняя величина 5 измерений служит исходной величиной для дальнейших вычислений массовой доли крахмала.

Обработка результатов

Массовую долю крахмала (X) в процентах вычисляют по следующим формулам. При использовании сахариметра с нормальной шкалой:

Х = К´а

или при использовании поляриметра с круговой шкалой:

, где

 - переводной коэффициент, который при длине трубки 2 дм равен 1,9;

а - показатель сахариметра или поляриметра в градусах шкалы (переводные коэффициенты  для длины трубки 1 дм умножают на 2).

Метрологические характеристики

Допустимые расхождения между результатами двух параллельных определений (r) не должны превышать значений:

r = 0,03 + 0,04×Х₁, но не более 0,5 % абсолютного содержания крахмала в БАД, где

Х₁ - среднее арифметическое двух параллельных определений.

Допустимые расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать значений:

R = 0,05 + 0,06×Х₂, но не более 1,2 % абсолютного содержания крахмала в продукте, где

Х₂ - среднее значение результатов измерений, выполненных в двух разных лабораториях.

2. Определение содержания и состава углеводов

2.1. Определение состава углеводов с помощью метода ГЖХ

Метод основан на переводе углеводов типа глюкозы, фруктозы, арабинозы, ксилозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, рафинозы, сорбита и инозита в БАД в триметилсилильные производные с последующим их газохроматографическим анализом.

Специфические реактивы, материалы и аппаратура

Гексан х.ч.

Гексаметилдисилазан.

Трифторуксусная кислота или триметилхлорсилан.

Пиридин х.ч., безводный.

Ксилит х.ч. или инозит.

Свинец уксуснокислый х.ч.

Неподвижные фазы для ГЖХ SE-30, OV-17, ХЕ-60, СКТФТ-50.

Инертный носитель для ГЖХ: хромосорб-W DMCS, хроматон-N DMCS.

Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором и устройством для программирования температуры.

Стеклянная насадочная колонка длиной 2 - 3 м и диаметром 3 - 4 мм или капиллярная колонка длиной 25 - 30 м с нанесенной фазой.

Микрошприц емкостью 1,0 - 10 мкл.

Роторный испаритель.

Подготовка образцов

БАД с низким содержанием лимонной кислоты (менее 1,5 %)

Содержание лимонной кислоты устанавливается по «Таблицам химического состава». Навеску гомогенизированной пробы БАД с высоким содержанием сухих веществ (более 60 %) наносят на полиэтиленовую пластинку в количестве 50 - 150 мг и взвешивают на аналитических весах с точностью до 0,0001 г. На этой же пластинке взвешивают 5 - 10 мг ксилита. Пластинку помещают в круглодонную колбу емкостью 10 - 25 см³ и силилируют без обезвоживания с использованием трифторуксусной кислоты. При использовании триметилхлорсилана содержимое колбы упаривают досуха на роторном испарителе при 60 °С под вакуумом. В случае медленного упаривания в колбу добавляют 1 см³ бензола. После упаривания проводят силилирование.

Жидкие БАД отмеряют пипеткой в количестве 0,5 - 1,0 см³ и помещают в круглодонную колбу емкостью 10 - 25 см³, снабженную шлифом. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят навеску 5 - 10 мг ксилита, взвешенного с точностью до 0,0001 г. Содержимое колбы упаривают досуха на роторном испарителе.

БАД с содержанием лимонной кислоты более 1,5 %

Для исключения наложения пика ТМС-производного лимонной кислоты на ТМС-производное b-глюкозы, лимонную кислоту осаждают уксуснокислым свинцом. Навеску средней гомогенизированной пробы БАД (содержащие лимонную кислоту, как пищевую или консервирующую добавку) в количестве 1 - 15 г взвешивают с точностью до 0,001 г в конической колбе емкостью 100 см³, приливают 30 см³ 75 - 80 % раствора этанола и экстрагируют 30 мин при температуре 60 - 70 °С. Используют водяную баню и обратный холодильник. Экстракцию повторяют трижды, экстракты объединяют.

Колбу доводят до метки дистиллированной водой. В центрифужную пробирку на 10 см³ вносят пипеткой 5 см³ отфильтрованного экстракта, 0,5 см³ насыщенного раствора уксуснокислого свинца. Осадок центрифугируется. 1 см³ надосадочной жидкости переносят в шлифную круглодонную колбу емкостью 10 - 25 см³. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят навеска ксилита 5 - 10 мг. Содержимое колбы упаривается на роторном испарителе при 60 °С под вакуумом.

Получение триметилсилильных (ТМС) производных

Способ с использованием трифторуксусной кислоты

В подготовленную навеску образца приливают точно 1,0 см³ пиридина, 0,9 см³ гексаметилдисилазана, 0,1 см³ трифторуксусной кислоты, плотно закрывают и энергично встряхивают в течение 30 с. Вначале наблюдают расслоение жидкости на 2 фазы, при этом нижний слой незначителен. По мере стояния раствора в течение 20 - 30 мин это расслоение исчезает и начинает выделяться аммиак, что указывает на успешное протекание реакции силилирования. После прекращения выделения аммиака раствор выдерживают 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 60 °С. Длительно сохраняющееся расслоение, исчезающее только при нагревании, говорит о том, что реакция силилирования прошла не полностью из-за высокого содержания влаги (более 40 %) или повышенного содержания углеводов. В этом случае подготовку пробы повторяют, уменьшив при этом навеску или увеличив время высушивания на роторном испарителе.

Способ с использованием триметилхлорсилана

В подготовленную навеску образца приливают точно 1,0 см³ пиридина, 0,2 см³ гексаметилдисилазана и 0,1 см³ триметилхлорсилана, встряхивают в течение 1 мин и нагревают в термостате 45 мин при 60 °С, затем хроматографируют.

Для упрощения идентификации и количественных расчетов (если не требуется знания аномерного состава сахаров) определение сахаров производят в виде ТМС-производных сахаров. В подготовленную пробу образца добавляют 100 г гидроксиламина солянокислого, приливают 10 см³ пиридина и выдерживают в термостате при 80 °С в течение 2 ч. Охлаждают и далее приливают силилирующие реагенты.

Газохроматографический анализ

Подготовка хроматографической колонки

Условия: Стеклянная колонка, наполненная сорбентом с 3 - 5 % неподвижной жидкой фазы длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм. Температуру колонки программируют от 125 до 270 °С со скоростью 4 °С в 1 мин, температуру испарителя 250 °С, расход газа-носителя 40 см³/мин, температура пламенно-ионизационного детектора 250 °С.

Газохроматографическое определение

1,0 мкл пиридинового раствора триметилсилильных производных углеводов вводят в испаритель хроматографа и элюируют из колонки газом-носителем. Идентификацию индивидуальных триметилсилильных производных проводят по времени удерживания триметилсилильных производных сахаров-метчиков и методом добавки.

Приготовление калибровочных растворов

Сахара, имеющие a- и b-аномеры

Навеску ксилита и навеску определяемого сахара, взятую с точностью до 0,0001 г, помещают в коническую колбу и заливают дистиллированной водой до полного растворения углеводов. Раствор выдерживают в течение суток. Аликвотную часть раствора отбирают пипеткой, помещают в круглодонную колбу и упаривают досуха, после чего проводят силилирование.

Сахара, не имеющие аномеров

Сахара, не имеющие аномеров, силилируют без предварительного растворения.

Обработка результатов

Массовую долю отдельных сахаров (в %) в навеске БАД определяют по формуле:

, где

С₁ - содержание отдельного сахара в навеске, %;

k₁ - поправочный коэффициент данного сахара;

С - масса навески стандарта, мг;

Q - навеска образца;

А_с - площадь пика стандарта в относительных единицах;

a₁ - площадь пика данного сахара в относительных единицах.

Расчет площадей хроматографических пиков сахарозы и a-лактозы при их совместном присутствии, в пробе

В виду того, что a-лактоза и сахароза выходят на хроматограмме одним пиком, площадь пика a-лактозы определяют, исходя из соотношения площадей a- и b-лактозы в модельном соединении лактозы. За основу берется площадь пика b-лактозы. Площадь пика сахарозы определяют вычитанием от суммарного пика сахарозы пика a-лактозы, рассчитанного из пика b-лактозы. За окончательный результат принимают среднеарифметическое (X) результатов двух параллельных определений.

Окончательный результат округляют до трехзначной цифры.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr), и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) зависят от содержания сахаров в продукте.

При содержании отдельных сахаров типа глюкозы, фруктозы, арабинозы, ксилозы, галактозы, сахарозы, лактозы, мальтозы, рафинозы, инозита и сорбита в продукте в пределах от 1 до 5 %:

·                    значения Rr = 20 %, RR = 40 % для каждого сахара; при содержании отдельного сахара в продукте свыше 5 %;

·                    значения Rr = 10 %, RR = 25 % для каждого сахара.

2.2. Определение состава углеводов с помощью метода ВЭЖХ

Настоящий метод основан на выделении, разделении и количественном определении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии моно-, ди-, олигосахаров, а также сахарных спиртов. Он распространяется на определение глюкозы, фруктозы, арабинозы, фукозы, галактозы, ксилозы, лактозы, лактулозы, мальтозы, мальтотриозы, маннозы, сахарозы, раффинозы, стахиозы, сорбита, инозита, мальтита, ксилита, изомальта, лактитола добавленных в БАД.

Приборы и реактивы

Прибор для проведения хроматографии методом ВЭЖХ, состоящий из насоса, детектора-рефрактометра, колонки 250 мм ´ 4 мм, Сепарон SGX NH₂ или аналогичная.

Компьютер с программным обеспечением по приему и обработке хроматографических данных.

Ротационный испаритель, водяная баня, обратный холодильник, две стеклянные колонки 7 - 10 см (внутренний диаметр 10 мм).

Ацетонитрил СН₃СN для хроматографии.

Этиловый спирт 80 %.

Ионообменная смола Дауэкс 50´4, 200 - 400 меш (Н⁺-форма).

Ионообменная смола Дауэкс 1´8, 200 - 400 меш (формиатная форма).

2Н NaOH, 3Н HCl, 3Н формиат натрия, бидистиллированная вода.

0,1 %-ный раствор азотнокислого серебра.

Изопропиловый спирт.

Экстракция

Углеводы извлекают из БАД 80 % этиловым спиртом с учетом естественной влаги. Навеску БАД заливают в колбе в соотношении 1:4 по сухим веществам 96 % этанолом и необходимым количеством воды с расчетом, чтобы общая концентрация спирта была в пределах 80 - 82 %. Колбу нагревают с обратным холодильником на водяной бане при 70 - 80 °С в течение 15 мин. Затем спиртовую вытяжку отфильтровывают. К остатку приливают опять раствор 80 %-ного спирта и экстракцию повторяют в тех же условиях. Всего углеводы экстрагируют из продукта 3 - 4 раза.

Спиртовые экстракты объединяют, спирт отгоняют на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С.

Очистка экстракта

Предназначенные для определения экстракты нейтральных сахаров содержат также вещества, имеющие заряд (аминокислоты, пептиды и др.) Чтобы освободить нейтральные сахара от этих примесей, экстракты пропускают через колонки с дауэксом 50´4, непосредственно соединенную с колонкой, содержащей дауэкс 1´8.

Подготовка дауэкс 50´4, 200 - 400 меш.

Смолу последовательно промывают на бюхнеровской воронке большими объемами 2н NaOH, дистиллированной водой, 3н HCl и опять водой. Избыток воды удаляют путем длительного отсасывания насосом. Готовят суспензию смолы в дистиллированной воде (1:1) и используют ее для заполнения колонки.

Ионнообменная способность для дауэкса 50´4 в сухом виде составляет 5,1 мэкв/см³ и во влажном 1,7 мэкв/см³ соответственно.

Подготовка дауэкс 1´8, 200 - 400 меш.

Для работы нужна формиатная форма смолы. Последнюю готовят из дауэкса 1´8 (СГ-форма), пропуская через смолу на бюхнеровской воронке 3н формиат натрия до тех пор, пока проба на СГ не станет отрицательной (проба с азотнокислым серебром). После этого смолу промывают большими объемами дистиллированной воды и заполняют колонку. Ионнообменная способность для дауэкса 1´8 в сухом виде составляет 3,2 мэкв/см³ и во влажном виде 1,4 мэкв/см³.

С двух колонок собирают элюент и, если необходимо, его концентрируют в роторном испарителе. Чтобы упарить воду и не поднимать температуру, к образцу добавляют этанол. Упаренный образец переносят в мерную посуду и замеряют объем и хроматографируют.

Анализ ВЭЖХ

Подготовка колонки

Для этого колонку промывают 40 см³ изопропанола, затем 80 см³ деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной фазой до стабильной нулевой линии.

Условия ВЭЖХ

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (77:23). Смесь дегазируют на роторном испарителе. Подвижная фаза для мальтотриозы, стахиозы и рафинозы: ацетонитрил-вода (60:40).

Детектирование - рефрактометр. Скорость потока 2,5 см³/мин. Стандартный раствор углевода 10 мг/см³ предварительно высушивают в сушильном шкафу при 105 °С до постоянного веса в стеклянных бюксах. Обработка хроматографических данных по программе МультиХром для Windows или аналогичной. Стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз. Ошибка метода ±5 % колонку.

Определение содержания глюкозы в смеси с сорбитом

При описанных выше условиях хроматографирования время удерживания глюкозы и сорбита одинаковое и на хроматограмме они выходят единым пиком. В таких случаях количество глюкозы определяют глюкозооксидазным методом с использованием соответствующего ферментативного набора. Проведение анализа описано в соответствующем наборе. Количество сорбита определяют расчетным способом, как разницу суммарного содержания глюкозы и сорбита (по хроматограмме) и глюкозы (полученной ферментативным методом). В связи с разницей рефрактометрического индекса глюкозы и сорбита в расчетную формулу вводят поправочный коэффициент:

, где

К - коэффициент пропорциональности, взятый из программы МультиХром.

3. Определение содержания пектина

Образец измельчают, взвешивают около от 1 до 5 г (в зависимости от того, сколько содержится пектина в образце), переносят в стеклянную колбу, заливают кипящей водой, в которую добавлена концентрированная соляная кислота из расчета 0,8 см³ на 250 см³ дистиллированной воды. Смесь нагревают при перемешивании в течение 30 мин при 95 - 100 °С. Охлаждают до температуры ниже 25 °С, чтобы свести к минимуму тепловое разрушение пектина, и фильтруют на воронке Бюхнера через капроновую ткань с отсасыванием. Если смесь плохо фильтруется, ее центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. Экстракцию проводят дважды, экстракты и промывную воду объединяют, измеряют количество и к охлажденному раствору пектина прибавляют 1,5 объема этанола (можно использовать изопропиловый спирт или ацетон), содержащего 2 см³ концентрированной соляной кислоты (уд. вес 1,19) на 1 л. Смесь перемешивают вручную медленно и тщательно и оставляют стоять на 30 мин с тем, чтобы пектин всплыл на поверхность. Большую часть не содержащего пектина раствора можно отделить сифонированием. Осадок пектина отделяют центрифугированием, промывают спиртом до тех пор, пока реакция с нитратом серебра на ион-хлорид в промывных растворах будет отрицательной. Осадок сушат в термостате при 60 °С до постоянного веса.

Содержание пектина определяют гравиметрически.

Ошибка метода 5 %. Метод не пригоден для БАД, содержащих большие количества (более 30 %) сахарозы.

4. Методы определения содержания редуцирующих веществ, общего сахара и сахарозы

4.1. Колориметрический метод

Метод основан на колориметрировании избытка щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия после реакции с редуцирующими сахарами объекта исследования. При этом гексацианоферрат (III) восстанавливается до гексацианоферрата (II), что ведет к ослаблению окраски, так как К₃[Fе(СN)₆] окрашен значительно интенсивнее, чем К₄[Fe(CN)₆].

Специфические реактивы

Глюкоза кристаллическая гидратная, х.ч., по ГОСТу 975-88.

Гексацианоферрат (III) калия, х.ч. по ГОСТу 4206-75.

Гидроксид калия, ч.д.а. по ГОСТу 24363-80 или гидроксид натрия, ч.д.а. по ГОСТу 4328-77, раствор с концентрацией NaOH (или КОН) 2,0М и 1,25М.

Кислота хлороводородная, х.ч. по ГОСТу 3118-77, раствор с концентрацией 1М.

Натрия хлорид, х.ч., по ГОСТу 4233-77.

Метиленовый голубой, индикатор, 1 г растворяют в 100 см³ дистиллированной воды и фильтруют.

Сахароза, х.ч. по ГОСТу 5833-75 или сахар-рафинад по ГОСТу 22-78.

Цинка сульфат, х.ч., по ГОСТу 4174-77, раствор с концентрацией 0,5М.

Внимание! Перед проведением анализа необходимо в обязательном порядке проверить вместимость мерной посуды и пипеток по I классу точности!

Подготовка к анализу

Приготовление раствора гексацианоферрата (III) калия - основной реактив. Взвешивают 8 г К₃[Fе(СN)₆] и 20 г NaOH (или 28 г КОН). Отдельно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Затем оба раствора сливают в мерную колбу вместимостью 1000 см³ и доводят до метки дистиллированной водой. Раствор готов к использованию через сутки. Раствор можно хранить в склянке из темного стекла в течение 2 мес.

Приготовление стандартного раствора глюкозы

1,6000 г безводной глюкозы взвешивают с точностью до 0,0002 г и растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 см³. Предварительно глюкозу выдерживают в эксикаторе над свежепрокаленным хлоридом кальция в течение 3 сут. После растворения навески раствор в колбе доводят до метки. Если раствор готовят на месяц, необходимо внести в колбу 150 г хлорида натрия и хранить в холодильнике.

Построение градуированного графика

В 6 конических колб вместимостью 100 см³ вносят пипеткой по 25 см³ щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия и по 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5 см³ стандартного раствора глюкозы. Из бюретки соответственно приливают 9,0; 8,5; 8,0; 7,5; 7,0 см³ дистиллированной воды, тем самым доводят объем жидкости в каждой колбе до 41 см³. Содержимое каждой колбы нагревают до кипения за 3 мин и кипятят в течение 1 мин, закрыв часовым стеклом. Затем охлаждают и измеряют оптическую плотность на ФЭК со светофильтром, имеющим l_эф = 440 нм (синий светофильтр). Раствором сравнения служит дистиллированная вода. Кювету подбирают такого размера, чтобы оптическая плотность была в пределах 0,3 - 0,6 для раствора, содержащего 8,5 см³ раствора глюкозы (10, 20 или 30 мм). Оптическую плотность определяют в каждом растворе не менее 3-х раз и из полученных данных берут среднее арифметическое значение. Строят график зависимости величины оптической плотности от концентрации глюкозы в растворе. Полученный график используют для определения содержания общего сахара, восстанавливающих сахаров и сахарозы.

Приготовление исследуемого раствора

Объект исследования тщательно измельчают в ступке. Затем готовят водную вытяжку объекта исследования. Массу навески М в граммах рассчитывают по формуле:

, где

V - вместимость колбы, см³;

Р - предполагаемое содержание общего сахара в объекте исследования, %;

С - оптимальная для данного метода концентрация сахаров в водной вытяжке на 100 см³ (принимают равной 0,16 г).

Растворение навески и осаждение несахаров проводят следующим образом. Образец измельченного исследуемого БАД взвешивают с погрешностью не более 0,01 г из такого расчета, чтобы в 100 см³ полученного раствора содержалось 0,3 - 0,4 г редуцирующих веществ. Массу навески М в граммах вычисляют по формуле:

, где

С - оптимальное содержание редуцирующих веществ в 100 см³ раствора навески, г;

V - вместимость мерной колбы, см³;

Р - предполагаемая массовая доля редуцирующих веществ в исследуемом изделии, %.

Навеску растворяют в стакане в дистиллированной воде, нагретой до 60 - 70 °С. Если БАД растворяется без остатка, то полученный в стакане раствор охлаждают и переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой и хорошо перемешивают. Если БАД в своем составе имеет вещества, нерастворимые в воде (мешающие несахара - белки, жиры, пектины, крахмал и т.д.), то навеску в стакане переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³, смывая нерастворимые частицы в колбу дистиллированной водой примерно до половины объема колбы. Органические кислоты, содержащиеся в навеске, нейтрализуют раствором углекислого натрия до рН 7,0, применяя для контроля универсальную индикаторную или лакмусовую бумагу. Колбу помещают в водяную баню, нагретую до 60 °С, при этой температуре, временами взбалтывая, выдерживают в течение 15 мин. Охладив раствор до комнатной температуры, осаждают мешающие несахара, прибавляя к раствору в колбе 10 см³ 1M раствора сульфата цинка, если масса навески была менее 5 г, и 15 см³, если масса навески была более 5 г, и такой объем 1М раствора гидроксида натрия, который установлен отдельным опытом при титровании соответствующего объема раствора сульфата цинка с фенолфталеином.

Содержимое колбы взбалтывают, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют в сухую колбу, которую предварительно ополаскивают 1 - 2 раза небольшой порцией фильтрата.

Допускается осаждение несахаров другими осадителями: растворами ацетата свинца и фосфата (или сульфата) натрия и растворами гексацианоферрата (II) калия и ацетата цинка. При осаждении несахаров ацетатом свинца к охлажденному до комнатной температуры раствору прибавляют мерным цилиндром 7 см³ раствора ацетата свинца, хорошо перемешивают и оставляют стоять 5 мин. Появление прозрачного слоя жидкости над осадком указывает на полноту осаждения, в противном случае вносят дополнительно по каплям раствор ацетата свинца до появления прозрачного слоя жидкости. Затем в эту же колбу для удаления избытка ацетата свинца вносят 18 - 20 см³ раствора фосфата (или сульфата) натрия.

Содержимое колбы взбалтывают, осадку дают отстояться. Для осаждения избытка ацетата свинца фосфатом натрия достаточно 10 мин. При осаждении сульфатом натрия при мутном растворе жидкость отстаивается 24 ч. После отстаивания проверяют полноту осаждения, приливая по стенке горлышка колбы нескольких капель раствора фосфата или сульфата натрия. При помутнении жидкости прибавляют дополнительно один из указанных выше растворов (1 - 2 см³), затем содержимое колбы взбалтывают, дают отстояться и снова проверяют полноту осаждения. При отсутствии помутнения в месте соприкосновения жидкостей содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и фильтруют в сухую колбу.

При осаждении несахаров раствором гексацианоферрата (II) калия к охлажденному до комнатной температуры раствору прибавляют пипеткой 2 см³ раствора гексацианоферрата (II) калия, взбалтывают, добавляют 2 см раствора ацетата цинка, снова взбалтывают и дают отстояться 5 мин. Если раствор над осадком остается мутным, добавляют большее количество указанных растворов в равных объемах. Содержимое колбы доводят водой до метки, перемешивают и фильтруют в сухую колбу. Во всех случаях фильтрат должен быть прозрачным.

При анализе окрашенных БАД (сокосодержацих и т.п.) необходимо связать красящие вещества и нейтрализовать органические кислоты раствором 1М гидроксида натрия или 1М гидроксида калия и связать дубильные вещества ацетатом свинца. Для этого добавляют к пробе по капле раствор карбоната натрия или 1М раствор гидроксида натрия до слабокислой или нейтральной реакции и 30 %-ный раствор ацетата свинца. После тщательного перемешивания и отстаивания добавляют по каплям раствор сульфата натрия до прекращения образования осадка, для связывания избытка ацетата свинца. Доводят водой до метки, отстаивают и фильтруют.

Проведение анализа

Определение восстанавливающих сахаров

В коническую колбу вместимостью 100 - 150 см³ вносят 10 см³ раствора пробы, 6 см³ дистиллированной воды и затем 25 см³ щелочного раствора гексацианоферрата калия. Колбу нагревают до кипения за 3 мин, кипятят 1 мин, охлаждают и измеряют оптическую плотность при l = 440 нм. Раствор сравнения - дистиллированная вода. Кювету берут размером, аналогичным взятому для построения градуировочного графика. Если оптическая плотность раствора не попадает в интервал 0,3 - 0,6, необходимо взять меньшую аликвоту пробы или поменять разведение, сохраняя постоянный объем жидкости в реакционной колбе, равным 41 см³. Результаты вычисляют, пользуясь градуировочным графиком и ниже приведенной формулой.

Определение общего сахара

Для определения общего сахара проводят гидролиз сахарозы. В реакционную коническую колбу вместимостью 100 - 150 см³ отмеривают пипеткой 10 см³ приготовленной вытяжки объекта и 4 см³ 1М раствора хлороводородной кислоты. Колбу ставят на электроплитку, жидкость доводят до кипения и кипятят 1 мин, охлаждают до комнатной температуры. Затем в колбу вносят 2 см³ 2М раствора гидроксида натрия (или калия) для нейтрализации кислоты и затем 25 см³ щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия. Содержимое колбы доводят до кипения и кипятят 1 мин. После охлаждения заполняют полученным раствором кювету и определяют оптическую плотность так же, как и при снятии градуировочного графика. Так как при значении оптической плотности в интервале 0,3 - 0,6 получаются более точные результаты, то при других значениях оптической плотности анализ повторяют, соответственно изменив объем вводимой водной вытяжки объекта исследования, добавив в воду так, чтобы общий объем оставался равным 10 см³.

Обработка результатов

Расчет содержания сахара

Содержание сахара Х_рс (в %), выраженное в глюкозе, вычисляют по формуле:

, где

М - количество глюкозы, найденное по градуировочному графику, мг;

V - объем исследуемого раствора, приготовленного из навески, м³;

V₁ - объем раствора, взятый для реакции с гексацианоферратом калия, см³;

т - масса навески объекта исследования, мг.

Для определения содержания общего сахара, выраженного в сахарозе, результат, полученный по формуле, умножают на 0,95. Если калибровку проводят с использованием раствора гидролизованной сахарозы, результат сразу выражают в % сахарозы. Для расчета содержания сахарозы из данных анализа общего сахара, выраженного в глюкозе, вычитают результат анализа содержания восстанавливающих сахаров и разницу умножают на коэффициент 0,95.

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений (X₁) и выражают целым числом с одним десятичным знаком.

Метрологические характеристики

Допустимые расхождения между результатами двух параллельных (r) определений не должны превышать:

r = 0,02 + 0,03×Х₁, но не более 0,5 % абсолютного содержания сахара в БАД, где

X₁ - среднее арифметическое значение двух параллельных определений.

Допустимое расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать:

R = 0,04 + 0,05×Х₂, но не более 1,0 % абсолютного значения содержания сахара в продукте, где

Х₂ - среднее значение результатов измерений, проведенных в двух разных лабораториях.

4.2. Титрометрический метод

Метод основан на титровании избытка гексацианоферрата калия стандартным раствором глюкозы в присутствии метиленового голубого до полного обесцвечивания.

Подготовку к анализу проводят также как и в колориметрическом методе.

Проведение анализа

Определение восстанавливающих сахаров

В коническую колбу вместимостью 100 - 150 см³ вносят 10 см³ раствора пробы, 25 см³ щелочного раствора гексацианоферрата калия. Колбу нагревают до кипения за 3 мин, кипятят ровно 3 мин и вводят 2 капли метиленового голубого, дотитровывают без прекращения кипячения раствором глюкозы до исчезновения синей окраски. Содержание сахаров определяют по формуле, представленной выше.

Холостой опыт проводят в тех же условиях, отбирая вместо 10 см³ раствора пробы 10 см³ стандартного раствора глюкозы.

Количество стандартного раствора глюкозы V₁, пошедшее на титрование 25 см³ щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия, суммируется как 10 см³ глюкозы, взятые на анализ, и объем глюкозы, который пошел на дотитровывание.

Определение общего сахара

Проводят предварительный гидролиз сахарозы. Затем вносят 25 см³ щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия и далее проводят кипячение и титрование, как и для определения восстанавливающих сахаров.

Расчет общего сахара

Содержание общего сахара (Х_ос) в %, выраженное в глюкозе, вычисляют по формуле:

, где

V₁ - количество стандартного раствора глюкозы, пошедшее на титрование 25 см³ щелочного раствора гексацианоферрата (III) калия в холостом опыте, см³;

V₂ - количество стандартного раствора глюкозы, пошедшее на дотитрование, см³;

1,6 - количество глюкозы в 1 см³ раствора, мг;

V_к - вместимость мерной колбы, используемой для приготовлении водной вытяжки, см³;

М - масса навески объекта исследования, мг.

Для получения содержания общего сахара, выраженного в сахарозе, результат, полученный по формуле, умножают на 0,95. Если калибровку проводят с использованием раствора гидролизованной сахарозы, результат сразу выражают в % сахарозы. Для расчета содержания сахарозы из данных анализа общего сахара, выраженного в глюкозе, вычитают результат анализа содержания восстанавливающих сахаров и разницу умножают на коэффициент 0,95.

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений (X₁) и выражают целым числом с одним десятичным знаком.

Метрологические характеристики фотометрического и титрометрического методов

Допустимые расхождения между результатами двух параллельных (r) определений не должны превышать:

r = 0,03 + 0,035×X₁, но не более 0,5 % абсолютного содержания сахара в БАД, где

X₁ - среднее арифметическое значение двух параллельных определений.

Допустимые расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать:

r = 0,04 + 0,05×X₂, но не более 1,0 % абсолютного содержания сахара в БАД, где

X₂ - среднее значение результатов измерений, проведенных в двух разных лабораториях.

5. Определение содержания нерастворимых и растворимых пищевых волокон (ферментативный метод)

Сущность метода заключается в гидролизе и удалении белковых и крахмалистых веществ ферментами, аналогичными ферментам пищеварительного тракта человека из БАД на растительной основе. Метод позволяет определять растворимые (в этиловом спирте) и нерастворимые пищевые волокна, отличающиеся физиологическим действием.

Специфическая аппаратура, материалы, реактивы

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г второго класса точности по ГОСТ 24104-80.

Шкаф сушильный лабораторный.

Спектрофотометр СФ-26 или другой с аналогичными характеристиками.

Водяная баня любого типа, обеспечивающая температуру нагрева 37±0,2 °С, 40±0,2 °С, 60±0,2 °С, 100 °С, или термостат.

Прибор для определения рН среды с диапазоном измерений 0 - 14 с погрешностью измерения ±0,1 ед. рН.

Воронки стеклянные с пористым фильтром № 40, № 100 по ГОСТ 25336-82.

Спирт этиловый по ГОСТ 5962-67 или ГОСТ 18300-72 и раствор с массовой долей этилового спирта 700 г/дм³.

Панкреатин, фармзавод Лейрас, А/О Хухтамяки, медицинский препарат, активность которого гарантирована в пределах установленных сроков хранения.

Глюкоамилаза очищенная по ТУ 64-13-18-88.

Гемоглобин бычий окисленный лиофилизированный МБ по ТУ 6-09-10-656-77.

Протеаза № Р-3910, Sigma Chemical Co. (хранится только в холодильнике) или другой протеолитический ферментный препарат аналогичной активности, например, пепсин А из слизистой оболочки желудка свиньи, активность которого устанавливают следующим образом. Сначала готовят 2 %-ный раствор гемоглобина. Для этого 300 мг гемоглобина растворяют в 12,9 см³ дистиллированной воды (до полного растворения), приливают 2,1 см³ раствора соляной кислоты концентрации 0,3М.

Определение активности проводят следующим образом: 68,5 мг пепсина растворяют в 10 см³ раствора соляной кислоты концентрации 0,03М; 0,2 см³ полученного раствора пепсина приливают к 1 см³ субстрата гемоглобина, предварительно нагретого на водяной бане в течение 5 мин при температуре 37 °С. Инкубируют смесь при той же температуре в течение 10 мин (по секундомеру). Реакцию останавливают путем приливания 5 см³ раствора соляной кислоты концентрации 100 г/дм³. Смесь выдерживают на водяной бане еще 5 мин. Фильтруют через плотный бумажный фильтр (фильтраты должны быть абсолютно прозрачными). Одновременно с опытными готовят контрольную пробу. Для этого к 1 см³ субстрата гемоглобина приливают 0,2 см³ раствора соляной кислоты концентрации 0,03М и 5 см³ 10 % раствора трихлоруксусной кислоты, затем инкубируют смесь и фильтруют по предложенной выше схеме. Содержание пепсина определяют спектрофотометрически: оптическую плотность опытных и контрольных фильтратов измеряют против дистиллированной воды при длине волны 280 нм в кюветах 1 см на СФ-26 или другом с подобными характеристиками.

Построение калибровочного графика: готовят ряд растворителей рабочего стандарта пепсина с концентрацией фермента 50, 100, 150, 200, 250 мкг/см³. Для этого пользуются следующими данными, приведенными в табл. 9.

Таблица 9

Количество ферментов

Во всех растворах, приготовленных по таблице, определяют содержание пепсина, как описано выше, и строят график, откладывая на оси ординат величины оптической плотности, а на оси абсцисс - концентрацию пепсина в мкг. По калибровочному графику определяют количество активного пепсина в исследуемом препарате. Результаты измерений выражают в протеиназных единицах (по гемоглобину), ПЕ_НВ. За протеиназную единицу принимают действие такого количества фермента, которое в данных условиях опыта и измерений за 1 мин приводит к увеличению оптической плотности фильтрата на единицу. Например, по предложенному калибровочному графику 250 мкг пепсина увеличивают оптическую плотность фильтрата на 0,5 за 10 мин, следовательно, 5 000 мкг пепсина приводит к увеличению оптической плотности на единицу за 1 мин (1 ПЕ_НВ = 5000 мкг или 1 мкг = 5´10^-3 ПЕ_НВ).

Подготовка к испытанию

Приготовление фосфатного буферного раствора панкреатина

Готовят 0,05М фосфатный буфер рН 6,0 (0,875 г дигидрофосфата и 6,05 г натрия гидрофосфата растворяют в примерно 700 см³ дистиллированной воды в колбе на 1 дм³, затем доводят до метки дистиллированной водой).

Готовят раствор панкреатина с концентрацией панкреатина в 0,05М фосфатном буфере 5 мг/см³.

Приготовление 0,5 %-ного водного раствора глюкоамилазы

Растворяют 500 мг глюкоамилазы в 100 см³ дистиллированной воды.

Подготовка образцов к испытанию

Исследуемый сухой материал измельчают на лабораторной мельнице, просеивают через сито, собирая фракцию с размером частиц не более 1 мм; влажный материал гомогенизируют в гомогенизаторе или микроизмельчителе тканей.

При содержании жира в образцах более 5 % проводят обезжиривание. Для этого навеску образца, предназначенную для определения пищевых волокон, заливают трехкратным объемом петролейного эфира (к массе образца), перемешивают в течение 15 мин периодически и затем отстаивают не менее 1 мин. Прозрачный раствор петролейного эфира декантируют и повторяют экстракцию с тем же количеством эфира 2 раза. Обезжиренный образец высушивают на воздухе.

Ориентировочное содержание крахмала в образце устанавливают по справочным таблицам или другим любым приемлемым методом.

Проведение испытания

0,5 г тонкоизмельченного образца, взвешенного с точностью до 0,0001 г, помещают в химический стакан и суспендируют в 30 см³ дистиллированной воды при 40 °С в течение 1,5 ч.

Полученную суспензию после настаивания нагревают на кипящей водяной бане для клейстеризации крахмала 30 мин при условии, что температура суспензии достигает 90 °С.

После охлаждения смеси до комнатной температуры устанавливают рН 1,5 ± 0,1 раствором соляной кислоты концентрацией 5М, добавляют 100 мг пепсина (активность 1 мкг эквивалентна 5´10^-3 ПЕ_НВ) и ставят на инкубацию при температуре 40 °С в течение 1 - 1,5 ч при периодическом помешивании. При недостаточной активности пепсина необходимо скорректировать его количество по вышеописанной методике при проведении ферментолиза.

Смесь охлаждают до комнатной температуры, затем устанавливают рН 6,8±0,1 раствором гидроксида натрия концентрацией 3М и приливают 10 см³ 0,05 молярного буферного раствора панкреатина. Смесь инкубируют в течение 1 - 1,5 ч при помешивании при температуре 40 °С. Охлаждают полученную смесь до комнатной температуры, приливают 1,0 см³ водного раствора глюкоамилазы концентрацией 50 мг/см³ (рекомендуется использовать 100 единиц активности глюкоамилазы на расщепление 1 г крахмала), устанавливают рН 4,8±0,1 раствором соляной кислоты концентрацией 5М и инкубируют при температуре 40 °С в течение 12 ч.

Полноту гидролиза крахмала определяют йодной пробой. Для этого несколько капель смеси помещают на стекло, добавляют каплю йода в водном растворе йодида калия. О присутствии крахмала в препарате пищевых волокон судят по наличию окрашенных в синий цвет крахмальных зерен. В случае положительной реакции на крахмал проводят обработку смеси дополнительным количеством глюкоамилазы (приливают к смеси 5 см³ водного раствора глюкоамилазы концентрацией 5 мг/см³ и инкубируют 1 ч при аналогичных условиях: рН 4,8±0,1, температура 60 °С).

Полученную смесь фильтруют через предварительно доведенный до постоянной массы фильтр № 100 или предварительно высушенный и взвешенный обеззоленный фильтр. Нерастворимые пищевые волокна, оставшиеся на фильтре, промывают последовательно 25 см³ 70 %-ного раствора этилового спирта (в 2 приема) и 25 см³ ацетона (в 2 приема). Фильтрат должен быть прозрачным.

Фильтр помещают в сушильный шкаф при температуре 105±1 °С и высушивают до постоянной массы. Фильтрат делят на 2 равные части. В одной части фильтрата осаждают растворимые пищевые волокна 4-кратным количеством 96 %-ного этилового спирта, взятого к объему фильтрата. Смесь оставляют для осаждения на 10 - 12 ч, затем фильтруют через доведенный до постоянной массы стеклянный пористый фильтр № 40 (при необходимости используют слабый вакуум) до получения прозрачного фильтрата. Остаток на фильтре промывают последовательно 25 см 70 %-ного раствора этилового спирта и 25 см³ ацетона, затем высушивают в сушильном шкафу при температуре 105±1 °С до постоянной массы.

В полученных препаратах нерастворимых пищевых волокон определяют содержание непереваренного белка по методу Кьельдаля и золы по ГОСТу 10847-74. Для корректировки данных по содержанию пищевых волокон от возможного осаждения остатка ферментов на растворимые и нерастворимые пищевые волокна параллельно проводят холостой опыт по вышеизложенной схеме, но без навески образца. Холостой опыт важно проводить при использовании новых партий ферментов.

Обработка результатов

Содержание пищевых волокон в БАД определяют по следующим формулам.

Для нерастворимых пищевых волокон:

.

Для растворимых пищевых волокон:

, где

X₁ - содержание нерастворимых пищевых волокон, %;

Х₂ - содержание растворимых пищевых волокон, %;

М - навеска образца, г;

m₁ и М₃ - масса остатка нерастворимых или растворимых пищевых волокон после высушивания соответственно, г;

m₂ - масса остатка в холостом опыте после высушивания, г;

В - содержание белка в препарате пищевых волокон, г;

С - содержание золы в препарате пищевых волокон, г.

Общее содержание пищевых волокон (X) вычисляют суммированием величин X₁ и Х₂.

За окончательный результат определения массовой доли нерастворимых или растворимых пищевых волокон принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Вычисление проводят до второго десятичного знака с последующим округлением до первого десятичного знака.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) приведены в табл. 10.

Таблица 10

Относительные допустимые внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения результатов определения

Глава 2

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОНУТРИЕНТОВ

I. Методы определения витаминов

1. Одновременное определение витаминов А, Е и каротиноидов в БАД методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Сущность метода

Метод определения витаминов А, Е и каротиноидов, включая b-каротин, a-каротин, ликопин, криптоксантин, лютеин, зеаксантин, при совместном присутствии в биологически активных добавках (витаминное драже, таблетки, порошки и кристаллические витаминные препараты, их растворы или суспензии в жирах) основан на экстракции микронутриентов органическим растворителем после щелочного омыления субстрата (1) или непосредственного растворения, упаривании полученного экстракта и переводе сухого остатка в другой растворитель, введении экстракта на ВЭЖХ колонку для хроматографического разделения и последующего определения с помощью флуоресцентного и спектрофотометрического детекторов (2). Определение массовой концентрации витаминов и каротиноидов основано на измерении площади (или высоты) пика при соответствующей каждому соединению длине волны детектирования после введения в хроматографическую систему анализируемых проб и градуировочных растворов.

Характеристика погрешности измерений

Настоящая методика измерений массовой концентрации жирорастворимых витаминов А, Е и каротиноидов в биологически активных добавках с вероятностью Р = 0,95 обеспечивает выполнение анализа с погрешностями ±15 % во всем диапазоне измерений.

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

Спектрофотометр, например, «СФ-46» с диапазоном измерения от 190 нм до 700 нм с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1 % по ТУ 3-3.1841-84; кюветы кварцевые рабочей длиной 10 мм.

Спектрофотометрический детектор для ВЭЖХ (типа «Джаско 870-UV», Япония) с проточной кюветой объемом 8 мкл (длина оптического пути 10 мм), уровнем относительной погрешности измерения не более 2 % с программируемой сменой длин волн, позволяющий проводить исследования в видимом и ультрафиолетовом диапазоне спектра (от 190 до 600 нм).

Спектрофлуориметрический детектор для ВЭЖХ (типа «Джаско» 821-FP) с проточной кварцевой кюветой объемом 16 мкл (длина оптического пути 10 мм), уровнем относительной погрешности измерения интенсивности флуоресценции не более 2 % с программируемой сменой длин волн, позволяющий проводить исследования в видимом и ультрафиолетовом диапазоне спектра возбуждения и эмиссии (от 220 - 650 нм).

Насос для ВЭЖХ (типа «Джаско» 880-PU), позволяющий осуществлять расход элюента 0,5 - 1,0 см³/мин с возможностью работы при давлении не менее 300 кг/см², погрешностью поддержания скорости подачи растворителя 0,6 см³/мин не более 2,5 %.

Микрошприц (типа «Гамильтон», США) вместимостью 100 мм³ для ввода проб в жидкостный хроматограф.

Регистрирующее устройство: интегратор (типа «Шимадзу C-R6A», Япония) или самописец, позволяющий проводить измерение с погрешностью не более 0,5 %.

Дозатор автоматический типа ПЛ-01-200.

Колбы мерные 2-100-2, 2-50-2 по ГОСТ 1770-74Е.

Цилиндры вместимостью 100 см³ по ГОСТ 1770-74Е.

Пробирки П-4-10-14/23 ХС по ГОСТ 25336.

Линейка металлическая с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427-75.

Вспомогательные устройства и материалы

Встряхиватель типа АВУ-6с по ТУ 64-1-2451-78.

Центрифуга ОПн-8-У4.2 по ТУ 5.375-4261-76.

Баллон с газообразным азотом квалификации «ос.ч» по ГОСТ 9293-74.

Реактивы

Метанол (СН₃ОН) для жидкостной хроматографии «ос.ч» по ТУ 6-09-2192-85.

Ацетонитрил (СН₃СN) для жидкостной хроматографии «ос.ч» по ТУ 6-09-14-2167-84.

Метилен хлористый (СН₂Сl₂), «ос.ч» по ТУ 6-09-14-2149-83.

Гексан (С₆Н₆), «хч» для хроматографии по ТУ 6-00-4521.

Спирт этиловый (C₂H₅OH) ректификованный технический по ГОСТ 18300-87.

Полностью транс-ретинол (С₂₀Н₃₀О) кристаллический, номер по каталогу 124769 фирмы «Мерк» (Германия).

Ретинола ацетат (С₂₂Н₃₂О₂) по Госфармакопея, X изд., ст. 578.

Ретинола пальмитат (С₂₆Н₆₀О₂) по ФС 42-2229-84.

DL-a-Токоферол (C₂₉H₅₀O₂), номер по каталогу Т3251 фирмы «Сигма».

a-Токоферола ацетат (C₃₁H₅₂O₂) по ФС 42-2495-87.

Каротиноиды: лютеин (С₄₀Н₅₆О₂), ликопин (C₄₀H₅₆), a-каротин (C₄₀H₅₆), b-каротин (C₄₀H₅₆), соответствующие номера Х6250, L9879, С0251, С9750 по каталогу фирмы «Сигма» (США), зексантин С₄₀Н₅₆О₂, b-криптоксантин (С₄₀Н₅₆О) фирмы «Рош» (Швейцария).

Калия гидроокись по ГОСТ 24363, ч.д.а.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Средства измерения должны быть поверены в установленные сроки. Допускается использование других средств измерения, вспомогательного оборудования и реактивов, имеющих аналогичные или лучшие характеристики.

Условия выполнения измерений

Для предотвращения разрушения витаминов и каротиноидов анализ БАД и стандартов проводят в присутствии антиоксиданта - аскорбиновой кислоты, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.

Подготовка к выполнению измерений

Приготовление растворов

1. Приготовление раствора гидроокиси калия с массовой долей 50 %.

50 г гидроокиси калия растворяют в 50 см³ дистиллированной воды.

2. Подвижная фаза для хроматографии

В мерную колбу на 500 см³ помещают 250 см³ ацетонитрила, 25 см³ дихлорметана и доводят объем смеси до метки метанолом. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения в темноте при 2 - 8 °С - 1 год.

Количественное определение витаминов А, Е и b-каротина

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, для чего проводят определение градуировочного коэффициента.

Для определения градуировочного коэффициента готовят несколько (не менее 4) калибровочных растворов витамина А (полностью транс-ретинол кристаллический; ретинола ацетат по Госфармакопея, X изд., ст. 578; ретинола пальмитат по ФС 42-2229-84) с концентрацией от 0,3 до 3 мкг/см³, витамина Е с концентрацией от 2 до 20 мкг/см³ (DL-a-токоферол; a-токоферола ацетат по ФС 42-2495-87), b-каротина с концентрацией от 0,2 до 1,5 мкг/см³.

Приготовление градуированных растворов витамина А

Для приготовления градуировочных растворов из ретинола 0,01 г витамина А количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 50 см³ этанола. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов ретинола, после чего объем в колбе доводят до метки этиловым спиртом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 см³ аликвоты раствора витамина А в этаноле (0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 см³) добавляют растворитель до метки.

Для приготовления калибровочных растворов из ацетата ретинола (пальмитата ретинола) 0,01 г витамина А помещают в коническую колбу вместимостью 100 см³, прибавляют 30 см³ этанола, 3 см³ 50 % раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре 63 - 68 °С. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят 50 см³ воды в делительную воронку и извлекают 150 см³ гексана (3 раза по 50 см³) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 мл до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу вместимостью 200 см³ и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Из полученного раствора отбирают 1, 2, 3, 4, 5 см³ раствора в мерные колбы вместимостью 100 см³, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в этаноле и доводят объемы до метки тем же растворителем.

Приготовление градуировочных растворов витамина Е

Для приготовления градуировочных растворов из a-токоферола 0,02 г витамина Е количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 2 см³ дихлорметана. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения токоферола, после чего объем в колбе доводят до метки этиловым спиртом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 см³ аликвоты раствора витамина Е в этаноле (1, 3, 5, 7, 10 см³) добавляют растворитель до метки.

Для приготовления градуировочных растворов из ацетата a-токоферола 0,02 г витамина Е количественно переносят в коническую колбу вместимостью 100 см³, добавляют 0,2 г аскорбиновой кислоты, 30 см³ этанола, 3 см³ 50 %-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре 63 - 68 °С. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят 50 см³ воды в делительную воронку и извлекают 150 см³ гексана (3 раза по 50 см³) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 мл до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу вместимостью 200 см³ и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Из полученного раствора отбирают 2, 4, 6, 8, 10 см³ раствора в мерные колбы вместимостью 100 см³, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в 1 см³ дихлорметана и доводят объемы до метки этанолом.

Приготовление градуировочных растворов каротиноидов

Для приготовления градуировочных растворов b-каротина 5 мг кристаллического b-каротина количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, добавляют 1 мл дихлорметана. Содержимое колбы тщательно перемешивают до полного растворения кристаллов, после чего объем в колбе доводят до метки этанолом и содержимое колбы вновь тщательно перемешивают. После введения в колбу на 100 см³ аликвоты раствора b-каротина в этаноле (0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 см³) добавляют растворитель до метки.

Градуировочные растворы других каротиноидов (a-каротина, ликопина, b-криптоксантина, лютеина, зеаксантина) готовят аналогично раствору b-каротина.

Полученные растворы хранят в холодильнике при 2 - 8 °С не более 6 месяцев.

Массовую концентрацию витаминов и каротиноидов в градуировочных растворах (С, мкг/см³) уточняют спектрофотометрическим методом. Для этого определяют оптическую плотность (D) слоя градуировочного раствора толщиной 1 см по отношению к растворителю при длине волны, указанной в таблице, и рассчитывают по формуле:

, где

 - коэффициент светопоглощения, см³×мкг^-1×см^-1;

1 - толщина слоя раствора, см;

10⁴ - коэффициент пересчета.

Таблица 11

Условия проведения спектрофотометрических измерений

Градуировка прибора

Градуировка хроматографической системы проводится с целью убедиться, что область определяемых концентраций лежит в пределах линейного участка градуировочного графика, построенного по площадям (высотам) пиков. Она проводится в следующих случаях:

·          на этапе освоения методики;

·          при смене колонки и/или предколонки;

·          при замене стандартного образца;

·          в других случаях, когда есть основания полагать, что изменилась эффективность хроматографической системы или чувствительность детектора.

Градуировку хроматографа проводят, строя градуировочный график по серии градуировочных растворов. Аналитический сигнал (площадь, мм² или высота пика, мм) фиксируют на интеграторе или самописце, соблюдая условия и продолжительность хроматографического разделения и детектирования (табл. 12).

Таблица 12

Условия детектирования витаминов А, Е и каротиноидов

Ориентировочные времена удерживания и последовательность выхода витаминов из хроматографической колонки: ретинол - 4,0 - 4,5 мин, a-токоферол - 10,5 - 11,0 мин (флуориметрическое детектирование), b-каротин > a-каротин > ликопин > b-криптоксантин > лютеин > зеаксантин (спектрофотометрическое детектирование).

Градуировочный график строят в координатах «аналитический сигнал» - «концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/см³». Для каждого анализируемого раствора проводят два параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времен удерживания не должно превышать 5 % от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций микронутриентов. Коэффициент градуировочного графика (k_гр) определяют как среднее арифметическое значение коэффициентов k_i, вычисляемых формуле:

, где

 - массовая концентрация микронутриентов в градуировочном растворе, мкг/см³;

S_i - площадь (высота) аналитического сигнала.

Описание хроматографической системы

Подготовку к работе хроматографической системы, состоящей из последовательно соединенных насоса высокого давления, спектрофотометрического и флуориметрического детекторов и интеграторов проводят в соответствии с руководством по эксплуатации.

Используется система для ВЭЖХ следующей конфигурации:

·       аналитическая хроматографическая колонка (типа картридж «Элсикарт» фирмы «Элсико», Россия) из нержавеющей стали, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4 мм, с обращеннофазным сорбентом, например Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим, аналогичным по свойствам, с эффективностью по b-каротину не ниже 5000 теоретических тарелок;

·       предколонка из нержавеющей стали длиной 50 мм, внутренним диаметром 4 мм с сорбентом типа «Нуклеосил» 100 С18, 7 мкм или аналогичным по свойствам;

·       петлевой кран-дозатор (инжектор ввода пробы типа «Реодайн 7125», США) с рабочим объемом петли 50 мм³;

·       объемная скорость подачи подвижной фазы - 0,6 см³/мин.

Подготовка пробы к анализу

Подготовка проб к анализу производится непосредственно перед анализом. Взвешивают не менее 10 таблеток (драже, порошкообразное содержимое капсул) и определяют вес одной штуки, затем материал тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала т, г (0,05 - 0,20 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 15 см³ воды и нагревают на водяной бане при температуре от 60 °С до 70 °С при перемешивании в течение 5 мин. Затем прибавляют 30 см³ этилового спирта, 0,1 г аскорбиновой кислоты, 3 см³ 50 %-ного раствора гидроокиси калия и нагревают в течение 30 мин на водяной бане с обратным холодильником при температуре кипения смеси. Содержимое колбы быстро охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят в делительную воронку и экстрагируют неомыляемые вещества 150 см³ гексана (3 раза по 50 см³) в течение двух минут. Объединенные гексановые экстракты промывают водой по 50 см³ до исчезновения щелочной реакции промывных вод (по универсальной индикаторной бумаге). Промытые гексановые экстракты количественно переносят в колбу объемом V₁ (200 см³) и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Аликвоту V₂ (2 см³) полученного раствора переносят в мерную пробирку на 10 см³, упаривают в токе азота, сухой остаток растворяют в точно измеренном объеме V₃ (1 см³) подвижной фазы.

Измерение концентрации витаминов и каротиноидов в экстракте пробы

Полученный раствор анализируют дважды с помощью хроматографической системы.

Идентификацию пиков проводят сопоставляя времена удерживания и спектральные отношения с временами удерживания и спектральными отношениями растворов соответствующих стандартов (табл. 13).

Таблица 13

Идентификация пиков витаминов и каротиноидов

Концентрацию витаминов и b-каротина в растворе пробы (С_пр, мкг/см³) определяют по формуле:

C_np = k_гpS_np, где

S_np - площадь (высота) пика витамина или каротиноида в растворе пробы;

K_гp - коэффициент градуировочного графика.

За окончательный результат определения концентрации микронутриентов в растворе пробы принимают среднее арифметическое результатов параллельных измерений, допускаемое относительное расхождение между которыми не должно превышать 5 % от среднего значения.

Представление результатов

Содержание микронутриентов (X), выраженное в мг на 1 г пищевой добавки, рассчитывают по формуле:

, где

С_пр - концентрация витамина или каротиноида в анализируемом растворе (мкг/см³); коэффициент 0,001 учитывает пересчет содержания витаминов и b-каротина в мг.

Минимально детектируемое количество ретинола и a-токоферола - 0,1 мкг/мл, каротиноидов - 0,05 мкг/мл.

Погрешность измерения вычисляется по формуле:

, где

 - характеристика погрешности измерений (п. 2), %.

Контроль погрешности результатов измерений

Для контроля погрешности результатов измерений массовой концентрации витаминов А, Е и b-каротина с помощью ВЭЖХ используют метод добавок.

Производят измерение концентрации витаминов и b-каротина в экстракте пробы в соответствии с п. 5.7 (С_пр, мкг/см³), а затем с введенной в него добавкой (С_д, мкг/см³), который также анализируют (С¢, мкг/см³). Величину добавки выбирают таким образом, чтобы концентрация микронутриентов в экстракте увеличилась на 50 - 150 %. Для добавки используют градуировочные растворы микронутриентов.

Результаты контроля считают удовлетворительными, если выполняется условие:

, где

К_д - норматив оперативного контроля погрешности, составляющий 15 %;

С_д - расчетное значение величины добавки, мкг/см³.

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

2. Определение витамина В-6 (пиридоксина) в БАД

Сущность метода

В биологически активных добавках витамин В-6 содержится в основном в виде пиридоксина гидрохлорида, действующим началом которого выступает пиридоксин (витамин В-6). Пиридоксин определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращеннофазовом ион-парном варианте в изократическом режиме со спектрофлуориметрическим детектированием. Массовую концентрацию пиридоксина определяют по площади (высоте) пика при соответствующих пиридоксину длинах волн флуориметрического детектирования после введения в хроматографическую систему анализируемых проб и градуировочных растворов.

Характеристика погрешности измерений

Настоящая методика измерений массовой концентрации пиридоксина в биологически активных добавках с вероятностью 0,95 обеспечивает выполнение анализа с погрешностями ±15 % во всем диапазоне измерений.

Описание хроматографической системы

Система для ВЭЖХ с спектрофлуориметрическим детектором с монохроматорами на линии возбуждения и эмиссии (или набором соответствующих фильтров в интервале длин волн от 220 - 650 нм) и аналитической хроматографической колонкой из нержавеющей стали, длиной 150 мм и 250 мм, внутренним диаметром 4 мм и 4,6 мм, с обращеннофазовым сорбентом типа Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим сорбентом, аналогичным по свойствам, с эффективностью по пиридоксину не ниже 8000 теоретических тарелок. (США) Р7949.

Подготовка к выполнению измерений

Условие выполнения измерений и подготовки проб

Для предотвращения разрушения пиридоксина под действием света подготовку проб и приготовление стандартных растворов пиридоксина проводят в посуде темного стекла, либо, обернув колбочки темной бумагой.

Приготовление растворов

Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией 0,1М.

К дистиллированной воде добавляют 4 см³ концентрированной соляной кислоты (r = 1,19 г/см³), объем доводят до 500 см³.

Раствор фосфорной кислоты с массовой долей 30 %.

41,3 г 85 %-ной фосфорной кислоты (r = 1,698 г/см³) растворяют в дистиллированной воде, доводят объем до 100 см³.

Приготовление 0,03М калий фосфатный буфер, рН 3,0.

4,08 г дигидроортофосфата калия растворяют в 500 см³ дистиллированной воды, доводят рН потенциометрически с помощью раствора фосфорной кислоты с массовой долей 30 % до значения 3,0 и объем доводят до 1000 см³.

Экстрагирующая смесь для гидролиза капсул с содержимым на жировой основе.

40 г винной кислоты растворяют в 800 см³ дистиллированной воды, добавляют 1 г Твина-80, объем доводят до 1000 см³.

Подвижная фаза для ВЭЖХ.

В мерную колбу вместимостью 500 см³ добавляют 100 - 150 см³ 0,03М калий фосфатного буфера, 20 см³ ацетонитрила, 326 мг гептилсульфоната натрия и доводят объем до метки фосфатным буфером. Раствор тщательно перемешивают и дегазируют на УЗ-бане в течение 10 мин.

Количественное определение пиридоксина (витамина В-6)

Количественное определение пиридоксина проводят методом абсолютной калибровки, определяя градуировочный коэффициент. Для определения градуировочного коэффициента готовят серию калибровочных растворов (не менее 5) с концентрациями пиридоксина в интервале от 0,01 до 0,200 мкг/см³.

Приготовление градуировочных растворов пиридоксина

Приготовление стандартного раствора пиридоксина гидрохлорида с концентрацией пиридоксина 500 мкг/см³

Точную навеску 61 мг пиридоксина гидрохлорида количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворяют в 0,1М растворе соляной кислоты и доводят объем этим же раствором до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию пиридоксина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции, равным 7000 M^-1×см^-1 в 0,1М растворе едкого натра при длине волны 308 нм [2]. Данный раствор можно хранить в холодильнике в течение 3 мес.

Градуировочные растворы пиридоксина готовят непосредственно перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 см³ аликвоты 1 см³ приготовленного стандартного раствора объем доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 100 см³ и получают раствор с концентрацией 5 мкг/см³. Для приготовления градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают аликвоты раствора пиридоксина с концентрацией 5 мкг/см³ (0,2; 0,6; 1,0; 4,0 см³) и доводят объемы до метки дистиллированной водой.

Градуировка прибора

Градуировку хроматографа проводят путем построения градуировочных графиков по серии градуировочных растворов стандартных растворов пиридоксина, приготовленных по п. 5.1. Аналитический сигнал (площадь в мм² или высота пика в мм) фиксируют на интеграторе или самописце при длине волны возбуждения 290 нм, эмиссии 395 нм. Ориентировочное время удерживания на хроматографической колонке 15,0 - 15,6 мин.

Градуировочный график строят в координатах «аналитический сигнал» - «концентрация пиридоксина в градуировочном растворе, мкг/см³». Для каждого анализируемого раствора проводят два параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времени удержания не должно превышать 5 % от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций пиридоксина. Коэффициент градуировочного графика (k_гp) определяют как среднее арифметическое значение коэффициентов k_i, вычисляемых по формуле:

, где

 - массовая концентрация пиридоксина в градуировочном растворе, мкг/см³,

S_i - площадь (высота) аналитического сигнала.

Подготовка проб к анализу

Подготовка проб проводится непосредственно перед анализом.

Таблетки или драже

Взвешивают не менее 10 таблеток (драже) и определяют вес одной (одного) таблетки (драже), затем материал тщательно растирают в фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала m, г (0,2 - 1,5 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 50 см³ 0,1М соляной кислоты, тщательно перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 20 мин.

Капсулы с порошкообразным содержимым

3 - 5 желатиновых капсул с порошкообразным содержимым помещают в кислоты и кипятят на водяной бане в течение 20 мин, периодически помешивая.

Капсулы с содержимым на жировой основе

3 - 5 капсул с содержимым на жировой основе помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 50 см³ экстрагирующей смеси и кипятят на водяной бане 30 минут, перемешивая через каждые 5 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной температуры, помещают на УЗ-баню на 5 мин, доводят экстрагирующей смесью объем до 50 см³ и фильтруют через бумажный фильтр.

При необходимости гидролизаты фильтруют через бумажный фильтр.

Измерение концентрации пиридоксина в экстракте пробы

Перед определением гидролизаты разводят дистиллированной водой в мерных колбах до концентрации, сопоставимой с концентрацией пиридоксина в растворах для построения градуировочного графика (0,03 - 0,05 мкг/см³).

Полученные из экстрактов растворы анализируют дважды с помощью хроматографической системы, вводя на колонку с помощью крана-дозатора (петля 0,1 см³).

Идентификацию пиков проводят, сопоставляя времена удерживания и спекральное отношение с временами удерживния и спектральными отношениями стандартного раствора пиридоксина (табл. 14).

Таблица 14

Идентификация пиков пиридоксина

Концентрацию пиридоксина в растворе пробы (С_пр, мкг/см³) определяют по формуле:

, где

S_np - площадь (высота) пика пиридоксина в растворе пробы;

k_гp - коэффициент градуировочного графика.

За окончательный результат определения концентрации пиридоксина в растворе пробы принимают среднее арифметическое результатов параллельных измерений, допускаемое относительное расхождение между которыми не должно превышать 5 % от среднего значения.

Обработка результатов

Содержание пиридоксина в 1 таблетке (драже) (мг):

, где

S_np - площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;

K_гp - коэффициент градуировочного графика;

V - первоначальный объем гидролизата, см³;

 - конечное разведение гидролизата;

т - навеска таблеток, взятая на анализ;

М - масса таблетки;

1000 - коэффициент пересчета мкг в мг.

Содержание пиридоксина в 1 капсуле (мг):

, где

S_np - площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;

k_гp - коэффициент градуировочного графика;

V - первоначальный объем гидролизата, см³;

 - конечное разведение гидролизата;

п - количество капсул, взятых на анализ;

1000 - коэффициент пересчета мкг в мг.

Контроль погрешности результатов измерений

Для контроля погрешности результатов измерений массовой концентрации пиридоксина с помощью ВЭЖХ используют метод добавок в гидролизат.

Производят измерение концентрации пиридоксина в гидролизате пробы (С_пр, мкг/см³), а затем с введенной в него добавкой (С_д, мкг/см³), который также анализируют (С¢, мкг/см³). Величину добавки выбирают таким образом, чтобы концентрация пиридоксина в гидролизате увеличилась на 50 - 150 %. Для добавки используют калибровочные растворы пиридоксина.

Результаты контроля считают удовлетворительными, если выполняется условие:

, где

К_д - норматив оперативного контроля погрешности (составляет 20 %);

С_д - расчетное значение величины добавки, мкг/см³.

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

Таблица 15

Метрологические характеристики метода

3. Одновременное определение витаминов в-1 и в-2 в бад методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Сущность метода

Витамин В-1 (тиамин) под действием красной кровяной соли превращается в тиохром, который флуоресцирует в щелочной среде. В данном варианте методики происходит постколоночная дериватизация, то есть после отделения тиамина от пробы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращеннофазовом ион-парном варианте в изократическом режиме, а окисляющий агент смешивается с выходящим из колонки элюатом, и образующийся тиохром детектируется флуориметрическим методом [1] при соответствующих длинах волн. Массовую концентрацию рибофлавина определяют по площади (высоте) пика при соответствущих ему длинах волн, так как это соединение способно флуоресцировать в нативном состоянии в растворе.

Характеристика погрешности измерений

Настоящая методика измерений массовой концентрации пиридоксина в биологически активных добавках с вероятностью 0,95 обеспечивает выполнение анализа с погрешностями ±15 % во всем диапазоне измерений.

Описание хроматографической системы

Система для ВЭЖХ со спектрофлуориметрическим детектором с монохроматорами на линии возбуждения и эмиссии (или набором соответствующих фильтров в интервале длин волн от 220 - 650 нм), двухходовым смесителем, в котором происходит реакция образования тиохрома из витамина В-1; и аналитической хроматографической колонкой из нержавеющей стали, длиной 150 мм и 250 мм, внутренним диаметром 4 мм и 4,6 мм, с обращеннофазовым сорбентом типа Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим сорбентом, аналогичным по свойствам, с эффективностью по тиамину и рибофлавину не ниже 8000 теоретических тарелок.

Подготовка к выполнению измерений

Условие выполнения измерений и подготовки проб

Для предотвращения разрушения рибофлавина и тиамина под действием света подготовку проб и приготовление их стандартных растворов, а также растворов гексацианоферрата (III) калия проводят в посуде темного стекла, либо, обернув колбочки темной бумагой.

Приготовление растворов

Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией 0,1М.

К дистиллированной воде добавляют 4 см³ концентрированной соляной кислоты (r = 1,19 г/см³), объем доводят до 500 см³.

Экстрагирующая смесь для гидролиза капсул с содержимым на жировой основе

40 г винной кислоты растворяют в 800 см³ дистиллированной воды, добавляют 1 г Твина-80, объем доводят до 1000 см³.

3,75 М раствор гидроксида натрия: К 75 г гидроксида натрия добавить 500 см³ дистиллированной воды.

0,04 М раствор гексаноцианоферрата (III) калия: 1,0 г гексаноцианоферрата (III) калия растворить в воде в мерной колбе вместимостью 100 см³ и довести дистиллированной водой до метки.

1,6 10³ М щелочной раствор гексаноцианоферрата (III) калия.

2,0 см³ раствора с содержанием гексаноцианоферрата (III) калия 10 г/1000 мл смешать в мерной колбе вместимостью 50 см³ с 3,75 М раствором гидроксида натрия и довести до метки этим же раствором.

Подвижная фаза для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 500 см³ добавляют примерно 50 см³ дистиллированной воды, 60 см³ метанола, 100 мг гептилсульфоната натрия, 10 см³ ледяной уксусной кислоты и доводят объем до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают и дегазируют на УЗ-бане в течение 10 мин.

Количественное определение витаминов В-1 и В-2

Количественное определение витаминов проводят методом абсолютной калибровки, определяя градуировочный коэффициент. Для определения градуировочного коэффициента готовят серию калибровочных растворов (не менее 5) тиамина с концентрациями в интервале от 0,01 до 0,200 мкг/см³, рибофлавина с концентрациями от 0,02 до 0,100 мкг/мл.

Приготовление градуированных растворов тиамина

Приготовление стандартного раствора тиамина гидрохлорида с концентрацией тиамина 1000 мкг/см³.

Точную навеску 62,5 мг тиамина гидрохлорида количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, растворяют в 0,1 М растворе соляной кислоты и доводят объем этим же раствором до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию пиридоксина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции, равным 14200 М^-1×см^-1 в 0,1 М растворе едкого натра при длине волны 247 нм [2]. Данный раствор можно хранить в холодильнике в течение 1 мес.

Градуировочные растворы тиамина готовят непосредственно перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 см³ аликвоты 1 см³ приготовленного стандартного раствора объем доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 100 см³ и получают раствор с концентрацией 10 мкг/см³. Для приготовления градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают аликвоты раствора тиамина с концентрацией 10 мкг/см³ (0,1; 0;2 0,5; 1,0; 2,0 см³) и доводят объемы до метки дистиллированной водой.

Приготовление градуированных растворов рибофлавина

Приготовление стандартного раствора рибофлавина с концентрацией тиамина 100 мкг/см³.

Точную навеску 10,0 мг рибофлавина количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют примерно 70 см³ воды и нагревают в течение 20 мин до полного растворения, после охлаждения и доводят объем водой до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Концентрацию рибофлавина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции, равным 12500 М^-1×см^-1 в 0,1М фосфатном буфере (рН = 7,0) при длине волны 255 нм [2]. Данный раствор можно хранить в холодильнике в течение 1 мес.

Градуировочные растворы рибофлавина готовят непосредственно перед определением. После введения в колбу вместимостью 100 см³ аликвоты 1 см³ приготовленного стандартного раствора объем доводят дистиллированной водой в мерной колбе до 50 см³ и получают раствор с концентрацией 2 мкг/см³. Для приготовления градуировочных растворов в мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают аликвоты раствора тиамина с концентрацией 10 мкг/см³ (1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 см³) и доводят объемы до метки дистиллированной водой.

Градуировка прибора

Градуировку хроматографа проводят путем построения градуировочных графиков по серии градуировочных растворов стандартных растворов пиридоксина, приготовленных по п. 5.1 - 5.2. Аналитический сигнал (площадь в мм² или высота пика в мм) фиксируют на интеграторе или самописце при длине волны возбуждения 375 нм, эмиссии 435 нм для тиамина и при длине волны возбуждения 450 нм, эмиссии - 521 нм (для рибофлавина). Ориентировочное время удерживания на хроматографической колонке 15,0 - 15,6 мин.

Градуировочный график строят в координатах «аналитический сигнал» - «концентрация пиридоксина в градуировочном растворе, мкг/см³». Для каждого анализируемого раствора проводят два параллельных измерения и находят среднее арифметическое. Различие между измеренными значениями аналитических сигналов и времени удержания не должно превышать 5 % от средних значений. Линейные участки градуировочного графика должны соответствовать всему диапазону определяемых концентраций витаминов. Коэффициент градуировочного графика (k_гp) определяют как среднее арифметическое значение коэффициентов k_i, вычисляемых по формуле:

, где

 - массовая концентрация витамина в градуировочном растворе, мкг/см³,

 - площадь (высота) аналитического сигнала.

Подготовка проб к анализу

Подготовка проб проводится непосредственно перед анализом. Подготовка проб аналогична таковой при определении пиридоксина, поэтому можно использовать один и тот же гидролизат.

Таблетки или драже

Взвешивают не менее 10 таблеток (драже) и определяют вес одной (одного) таблетки (драже), затем материал тщательно растирают в фарфоровой ступке. Точную навеску анализируемого материала m, г (0,2 - 1,5 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 50 см³ 0,1М соляной кислоты, тщательно перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 20 мин. При необходимости гидролизаты фильтруют через бумажный фильтр.

Капсулы с порошкообразным содержимым

3 - 5 желатиновых капсул с порошкообразным содержимым помещают в кислоты и кипятят на водяной бане в течение 20 минут, периодически помешивая.

Капсулы с содержимым на жировой основе

3 - 5 капсул с содержимым на жировой основе помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 50 см³ экстрагирующей смеси и кипятят на водяной бане 30 минут, перемешивая через каждые 5 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной температуры, помещают на УЗ-баню на 5 мин, доводят экстрагирующей смесью объем до 50 см³ и фильтруют через бумажный фильтр.

Измерение концентраций тиамина и рибофлавина в экстракте пробы

Перед определением гидролизаты разводят дистиллированной водой в мерных колбах до концентрации, сопоставимой с концентрациями витаминов в растворах для построения градуировочного графика.

Аликвоту фильтрата 0,1 см³ вводили в аналитическую хроматографическую колонку. Витамин В-1 определяли после окисления его в тиохром путем послеколоночной дериватизации 0,06 %-ным раствором калия гексацианоферрата (III) в 3 N гидроокиси калия со скоростью подачи реагента 0,1 см³ в течение 5 мин после ввода пробы. Длина волны возбуждения для тиохрома составляла 375 нм, длина волны флуоресценции - 435 нм. Время удерживания витамина В-1 - 4,0 - 4,5 мин. После 6-й минуты длины волн автоматически переключались для определения витамина В-2. Длина волны возбуждения для рибофлавина (витамина В-2) составляла 450 нм, длина волны флуоресценции - 521 нм. Время удерживания витамина В-2 составляло 10,0 - 10,3 мин. Идентификацию пиков проводили, сопоставляя времена удерживания с временами удерживания растворов соответствующих стандартов.

Идентификацию пиков проводят, сопоставляя времена удерживания и спектральное отношение с временами удерживания и спектральными отношениями стандартного раствора пиридоксина (табл. 16).

Таблица 16

Идентификация пиков тиамина рибофлавина

Концентрацию витаминов в растворе пробы (С_пр, мкг/см³) определяют по формуле:

C_np = k_гp×S_np, где

S_np - площадь (высота) пика витаминов в растворе пробы;

K_гp - коэффициент градуировочног графика.

За окончательный результат определения концентрации пиридоксина в растворе пробы принимают среднее арифметическое результатов параллельных измерений, допускаемое относительное расхождение между которыми не должно превышать 5 % от среднего значения.

Обработка результатов

Содержание тиамина (рибофлавина) в 1 таблетке (драже) (мг):

, где

S_np - площадь (высота) пика витамина в пробе;

k_гp - коэффициент градуировочного графика;

V - первоначальный объем гидролизата, см³;

k_разв - конечное разведение гидролизата;

т - навеска таблеток, взятая на анализ;

М - масса таблетки;

1000 - коэффициент пересчета мкг в мг.

Содержание тиамина (рибофлавина) в 1 капсуле (мг):

, где

S_np - площадь (высота) пика пиридоксина в пробе;

k_гp - коэффициент градуировочного графика;

V - первоначальный объем гидролизата, см³;

k_разв - конечное разведение гидролизата;

п - количество капсул, взятых на анализ;

1000 - коэффициент пересчета мкг в мг.

Контроль погрешности результатов измерений

Для контроля погрешности результатов измерений массовой концентрации пиридоксина с помощью ВЭЖХ используют метод добавок в гидролизат.

Производят измерение концентрации тиамина или рибофлавина в гидролизате пробы (С_пр, мкг/см³), а затем с введенной в него добавкой (С_д, мкг/см³), который также анализируют (С¢, мкг/см³). Величину добавки выбирают таким образом, чтобы концентрация данного витамина в гидролизате увеличилась на 50 - 150 %. Для добавки используют калибровочные растворы.

Результаты контроля считают удовлетворительными, если выполняется условие:

, где

К_д - норматив оперативного контроля погрешности (составляет 20 %);

С_д - расчетное значение величины добавки, мкг/см³.

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

Таблица 17

Метрологические характеристики метода

4. Флуориметрический метод определения рибофлавина (витамин В2) титрованием рибофлавинсвязывающим апобелком

Принцип метода основан на способности рибофлавинсвязывающего апобелка при связывании с рибофлавином полностью тушить его флуоресценцию.

Реактивы и их приготовление

0,1 н. соляная кислота (НСl).

К дистиллированной воде добавляют 0,8 см³ концентрированной (r = 1,19 г/см³) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем доводят до 100 см³.

Стандартный раствор рибофлавина (С₁₇H₂₀N₄O₆) концентрацией 100 мкг/см³.

5 мг рибофлавина растворяют при нагревании на водяной бане при 70 °С в 45 см³ 0,1 н. соляной кислоты (раствор 1). После охлаждения объем доводят до 50 см³. Концентрацию рибофлавина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экмтинкции (прилож. 3). Раствор можно хранить в холодильнике в течение 6 мес.

Рабочий стандартный раствор (концентрация рибофлавина 2 мкг/см³).

Перед определением к 1 см³ стандартного раствора добавляют дистиллированную воду в мерной колбе до объема 50 см³.

4 М фосфат калия однозамещенный (К₂НРО₄).

54,4 г К₂НРО₄ растворяют в дистиллированной воде, объем доводят до 100 см³.

Рибофлавинсвязывающий апобелок (РбСБ) со связывающей способностью 5 - 15 мкг рибофлавина на 1 мг белка.

Можно использовать коммерческий препарат (Sigma, США, R 8628) или выделить его из белка куриного яйца по методу, изложенному в прилож. 3.

Средства измерений

Спектрофлуориметр F-2000 (Hitachi, Япония) или аналогичный по оптическим характеристикам.

Условия измерения

Интенсивность флуоресценции измеряют в кварцевой кювете объемом 3 см³ с длиной оптического пути 1 см при длине волны возбуждающего света l_возб = 465 нм, испускаемого l_фл = 525 нм.

Приготовление кислотного гидролизата

3 таблетки (драже) или содержимое 3 капсул растирают и тщательно перемешивают в ступке. При расчете массы навески исходят из того, чтобы в 1 см³ гидролизата содержалось не более 5 мкг рибофлавина. К навеске (100 - 500 мг в зависимости от содержания витамина) добавляют 100 см³ 0,1 н. НСl и помещают на кипящую водяную баню на 40 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной температуры, доводят объем дистиллированной водой до 100 см³ и при необходимости фильтруют.

В случае необходимости разводят гидролизат до концентрации рибофлавина около 0,5 мкг/см³ или уменьшают количество гидролизата, взятого на анализ, с таким расчетом, чтобы интенсивность флуоресценции опытной пробы (о - к) была сопоставима с интенсивностью флуоресценции добавленного в пробу стандарта (с - о).

Ход определения

К 0,1 см³ кислотного гидролизата добавляют равный объем 4М К₂НРО₄ и дистиллированную воду до 3 см³, измеряют флуоресценцию (о), добавляют 0,03 см³ стандартного раствора рибофлавина концентрацией 2 мкг/см³. После перемешивания повторяют измерение (с). Затем добавляют по 0,03 см³ раствора РбСБ, перемешивают, измеряют флуоресценцию после каждой добавки белка. Добавление белка продолжают до тех пор, пока флуоресценция после двух добавок перестает снижаться (к). Разница интенсивности флуоресценции (о - к) пропорциональна количеству рибофлавина в гидролизате. Необходимое количество РбСБ подбирают эмпирически.

Обработка результатов

Содержание рибофлавина в 1 таблетке (мг):

, где

0,06 - количество рибофлавина, внесенное в кювету, мкг;

V - исходный объем гидролизата, см³;

М - масса таблетки БАД, г;

V₁ - объем гидролизата, внесенного в пробу, см³;

т - навеска измельченных таблеток, взятая на анализ, г;

1000 - перевод мкг в мг.

Таблица 18

Метрологические характеристики метода

5. Метод определения аскорбиновой кислоты (витамин С)

Определение витамина С в биологически активных добавках к пище основано на определении непосредственно аскорбиновой кислоты (АК) без учета окисленной формы витамина С - дегидроаскорбиновой кислоты (ДАК).

Для целей рутинного анализа наиболее легко и доступно определение методом визуального титрования с использованием количественного окисления АК раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Однако этот метод применим только для объектов исследования, дающих светлоокрашенные экстракты. В других случаях используют метод потенциометрического титрования, спектрофотометрические и флуорометрический методы анализа, которые применимы для любых объектов исследования.

Аппаратура, материалы и реактивы

Спектрофотометр с диапазоном измерения от 220 до 1100 нм или фотоэлектроколориметр с диапазоном измерения от 364 до 2980 нм с диапазоном измерения коэффициента пропускания от 100 до 1 %.

Флуориметр типа «Квант» с набором светофильтров или спектрофлюориметр.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные общего назначения 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Секундомер 2-го класса или часы 2-го класса.

РН-метр-милливольтметр лабораторный для измерения рН и окислительно-восстановительных потенциалов с диапазонами от минус 1 до плюс 14 мВ и погрешностью не более ±0,05 при измерении рН и диапазонами от минус 100 до плюс 1400 мВ и погрешностью не более ±5 мВ при измерении окислительно-восстановительных потенциалов. При измерении окислительно-восстановительных потенциалов используют электроды: измерительный - платиновый, вспомогательный - хлорсеребряный.

Термостат с поддержанием заданного режима от 0 до 60 °С с погрешностью ±0,8 °С.

Термометр жидкостный с диапазоном измерения от 0 до 100 °С с ценой деления шкалы 1 °С.

Мешалка магнитная с плавным регулированием частоты вращения.

Воронки стеклянные лабораторные типа В по ГОСТ 25336.

Колбы мерные лабораторные стеклянные номинальной вместимостью 50, 100, 500, 1000 см³ по ГОСТ 1770.

Колбы типа Кн исполнения 2 номинальной вместимостью 50, 100, 250, 750 см³ по ГОСТ 25336.

Микробюретка по ГОСТ 20292 с ценой деления не более 0,01 см³.

Палочки стеклянные.

Пипетки мерные лабораторные стеклянные по ГОСТ 20292 номинальной вместимостью 1, 2, 5, 10 см³ ценой деления шкалы 0,1 см³.

Стаканы типа В исполнения 1 номинальной вместимостью 50, 100, 400, 1000 см³ по ГОСТ 25336.

Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.

Цилиндры мерные лабораторные стеклянные вместимостью 100, 250 см³ по ГОСТ 1770.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Бумага масштабно-координатная (миллиметровая) по ГОСТ 334.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Ацетон по ГОСТ 2603.

Кислота азотная по ГОСТ 4461 плотностью 1,41 г/см³, раствор с объемной долей 25 %.

Кислота аскорбиновая по ГФ XI изд., растворы массовых концентраций 1,0 и 0,1 г/дм³.

Кислота борная, ч.

Кислота серная о.с.ч. или ч.д.а. (предпочтительней по Савалю).

Кислота соляная плотностью 1,19 г/см³, х.ч., раствор с массовой долей 2 %.

Кислота трихлоруксусная, х.ч., раствор с массовой долей 3 %.

Кислота фосфорная (мета), ч. по ГОСТ 841, растворы с массовой долей 3 и 6 %.

Кислота уксусная ледяная, ч.д.а. или х.ч. по ГОСТ 61, раствор с массовой долей 3 %.

Кислота хлорная, раствор молярной концентрации 0,1 моль/дм³. Готовят перед обработкой электродов.

Кислота щавелевая, раствор с массовой долей 2 %.

Ксилол.

Натрий 2,6-дихлорфенолиндофенолят, х.ч., Serva

Натрий уксуснокислый, 3-водный, ч.д.а. по ГОСТ 199.

О-Фенилендиамин, раствор 0,2 г/дм³.

Формальдегид, 36 - 40 %-ный раствор.

Уголь активированный.

L-цистеин солянокислый или L-цистеин, 50 мг в 1 см³ 2 %-ного раствора соляной кислоты.

Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) или трилон Б (динатриевая соль этилендиамина-N, N¢, N¢-тетрауксусной кислоты, 2-водная, ч.д.а.).

Эфир уксусной кислоты бутиловый (бутилацетат), х.ч.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже вышеуказанных.

Хранение растворов по ГОСТ 4212.

Методы отбора проб

Подготовка средней пробы к анализу

Подготовка проб к анализу производится непосредственно перед анализом. Выделение витамина необходимо осуществлять возможно быстрее, без использования повышенной температуры, не на ярком свету и при минимальном контакте образца с кислородом воздуха.

Дражированная форма

Из средней пробы драже отбирают 10 - 15 шт., взвешивают их и определяют вес одной штуки, затем тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке.

Таблетированная форма

Из средней пробы таблеток отбирают 3 - 7 шт., взвешивают их и определяют вес одной штуки, затем тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке.

Капсулированная форма

Из средней пробы капсул с порошкообразным содержимым отбирают 3 - 7 шт., взвешивают их и определяют вес одной штуки за вычетом массы оболочки, затем содержимое капсул тщательно растирают и перемешивают в фарфоровой ступке.

Из средней пробы «жировых» капсул отбирают 3 - 7 шт., взвешивают их, затем осторожно вскрывают, содержимое капсул тщательно перемешивают. Оболочки капсул отмывают органическим растворителем (ацетоном, гексаном и др.), высушивают и взвешивают. Затем высчитывают массу содержимого одной капсулы.

Кристаллические витаминные препараты (субстанции и премиксы)

Пробу витаминных препаратов отбирают в количестве 5 - 10 г и тщательно перемешивают.

Порошкообразная форма

Среднюю пробу порошкообразных веществ (сухие напитки, сухие молочные смеси и каши для детского питания и т.д.) отбирают в количестве 25 - 50 г. Перед взятием пробы порошок тщательно перемешивают.

Примечание. При исследовании равномерности перемешивания сыпучих продуктов, расфасованных в порционные упаковки, целесообразно при проведении анализа использовать порционную упаковку исследуемого образца целиком.

Жидкие витаминные препараты и обогащенные продукты

Жидкие витаминные препараты и обогащенные продукты в количестве 50 - 100 см³ осторожно, избегая аэрации, перемешивают путем многократного переворачивания склянки, содержащей пробу.

Витаминизированные кондитерские изделия (конфеты, вафли, батончики, бисквиты и др.)

Пробу штучных изделий берут в количестве не менее 100 - 200 г (в зависимости от содержания витамина), взвешивают, определяют вес единицы изделия, а затем подвергают размельчению и растиранию в ступке.

Подготовка аналитической пробы

Из измельченной и перемешанной пробы берут навеску не менее 0,5 - 1 г, взвешенную с погрешностью ±0,0001 г. При расчете массы необходимой навески можно пользоваться следующей формулой:

, где

т - навеска исследуемого образца, г

 - общий объем экстракта, мл

V_np - объем экстракта, взятого на титрование, мл

 - заявленное содержание АК в исследуемом образце, мг/100 г.

Навески жидких проб (витаминизированные соки, напитки и т.п.) отбирают пипеткой. Навески проб густой консистенции (сиропы, концентраты и пр.), плохо стекающие из пипетки, берут весовым путем подобно твердым продуктам. Затем в этих пробах определяют по общим правилам плотность для пересчета содержания витамина на единицу объема.

5.1 Определение витамина С в образцах, дающих неокрашенные или слабоокрашенные экстракты

Сущность метода

Определение витамина С в образцах, дающих неокрашенные или слабоокрашенные экстракты основано на экстрагировании аскорбиновой кислоты или ее солей раствором кислоты (соляной, щавелевой, трихлоруксусной, метафосфорной или смесью уксусной и метафосфорной) с последующим визуальным титрованием раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия до установления светло-розовой окраски.

Подготовка к выполнению измерения (испытанию)

Выбор экстрагирующего раствора

Таблица 19

Экстрагирующие агенты

При выборе экстрагирующего агента также следует учитывать влияние мешающих определению компонентов исследуемой матрицы (табл. 20).

Таблица 20

Компоненты, мешающие определению АК

Приготовление экстрагирующего раствора

Приготовление водного раствора соляной кислоты массовой концентрации 20 г/дм³ (2 %)

47,5 см³ 36 %-ной соляной кислоты доводят до метки в 1000 см³ мерной колбе дистиллированной водой.

Приготовление водного раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 30 г/дм³ (3 %).

30 г кристаллической трихлоруксусной кислоты доводят до метки в 1000 см³ мерной колбе дистиллированной водой.

Приготовление водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/дм³

Взвешивают 60,00 г растертой в ступке метафосфорной кислоты на весах 4-го класса точности, растворяют без нагревания в 100 - 200 см³ дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 см³, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют. Раствор хранят при (6±2) °С не более 7 сут.

Приготовление водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 30 г/дм³

Необходимый для измерения объем водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/дм³ смешивают с дистиллированной водой в соотношения 1:1. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Приготовление водного раствора трилона Б (этилендиаминтетраацетат натрия) молярной концентрации с = 0,05 моль/дм³

Взвешивают 1,8 г трилона Б на весах 2 класса точности и растворяют в 100 - 300 см³ дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 см³, доливая дистиллированную воду до метки.

Приготовление смеси водного раствора трилона Б (этилендиаминтетраацетат натрия) в молярной концентрации с = 0,05 моль/дм³ и раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/дм³ или раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 30 г/дм³ (раствор осадителя)

Отмеряют цилиндром 300 см³ водного раствора метафосфорной кислоты массовой концентрации 60 г/дм³ (или водного раствора трихлоруксусной кислоты массовом концентрации 30 г/дм³) и 300 см³ раствора трилона Б (этилендиаминтетраацетат натрия) молярной концентрации с = 0,05 моль/дм³ в коническую колбу объемом 750 см³ и перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Приготовление смеси уксусной и метафосфорной кислот

К раствору 15 г метафосфорной кислоты в 200 см³ дистиллированной воды добавляют 40 см³ ледяной уксусной кислоты и доводят дистиллированной водой до 500 см³. Хранят в склянке с притертой пробкой в холодильнике в течение 7 дней.

Приготовление стандартного раствора АК

Растворяют 0,1000 г (точная навеска) аскорбиновой кислоты, отвечающей требованиям ГФ XI, в мерной колбе емкостью 100 см³ в выбранном экстрагирующем растворе и доводят тем же раствором до метки, 10 см³ полученного раствора АК помещают в мерную колбу на 100 см³ и доводят до метки раствором, используемым в качестве экстрагирующего. Раствор готовят непосредственно перед применением.

Приготовление раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (раствор красителя) и определение его титра

Взвешивают 0,100 г 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия на весах 2 класса точности, растворяют, тщательно перемешивая, в 250 см³ свежекипяченой дистиллированной воды температурой (90±5) °С содержащей около 50 мг бикарбоната натрия. После охлаждения раствора до (20±5) °С, доводят до метки дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 500 см³, затем фильтруют через складчатый фильтр в склянку из темного стекла. Раствор хранят при (6±2) °С не более 1 месяца.

Определение титра

К 1 мл стандартного раствора АК добавляют 9 см³ выбранного экстрагирующего раствора и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до розового окрашивания, не исчезающего в течение 15 - 20 с (V_m). Таким же образом титруют 10 см³ экстрагирующего раствора (V_к). Поправку к титру раствора (Т), в мг АК, эквивалентных 1 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, вычисляют по формуле:

, где

К - количество АК в 1 мл стандартного раствора, мг.

Приготовление раствора ацетатного буфера с рН 4,0

Растворяют 30 г безводного уксуснокислого натрия в 70 см³ дистиллированной воды и, добавляя ледяную уксусную кислоту (около 100 см³), потенциометрически доводят рН до 4,0.

Приготовление раствора ацетатного буфера с рН 5,0

Растворяют 30 г безводного уксуснокислого натрия в 70 см³ дистиллированной воды и, добавляя ледяную уксусную кислоту (около 50 см³), потенциометрически доводят рН до 5,0.

Приготовление 1,0 М раствора соляной кислоты

17,2 мл 36 % соляной кислоты разбавляют дистиллированной водой в мерной колбе емкостью на 200 см³ и доводят до метки дистиллированной водой.

Приготовление 1,0 М раствора ацетата натрия

82,0 г безводного ацетата натрия растворяют в мерной колбе емкостью 1000 см³ дистиллированной водой и доводят до метки.

Приготовление солянокислого буфера с рН 5,2

К 40 см³ 1,0 М раствора соляной кислоты приливают 200 см³ 1,0 М раствора ацетата натрия и доводят до метки дистиллированной водой в мерной колбе емкостью 1000 см³.

Проведение испытания

Экстрагирование

Для приготовления экстракта рассчитанную массу навески взвешивают с погрешностью ±0,0001 г. Затем гомогенизируют ее с небольшим количеством выбранного экстрагирующего агента. После чего полученный гомогенат количественно переносят в мерную колбу или мерный цилиндр объемом V_общ, доводят до метки экстрагирующим агентом, тщательно перемешивают, настаивают 5 - 10 мин и фильтруют через складчатый фильтр или центрифугируют. Для жидких пищевых добавок необходимое количество материала отмеривают пипеткой и доводят до метки экстрагирующим агентом в соответствующей мерной колбе.

Визуальное титрование

Для определения АК 1 - 10 мл экстракта с общим содержанием АК около 0,1 мг вносят пипеткой в коническую колбу вместимостью 50 или 100 см³, доводят объем экстрагентом до 10 см³ и титруют раствором 2,6-дихлор-фенолиндофенолята натрия до слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 15 - 20 с. Аналогично титруют равный объем экстрагирующего агента (контроль на реактивы)*.

Обработка результатов измерения

Содержание АК (X), выраженное в мг на 1 г пищевой добавки вычисляют по формуле:

, где

Т - титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, мг/см³;

V_m - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, пошедший на титрование исследуемого раствора, см³;

V_к - объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, пошедший на контрольное испытание, см³;

остальные обозначения см. выше.

Для пищевых добавок, содержащих редуцирующие примеси вместо контроля на реактивы проводят контрольное испытание на присутствие этих примесей. Для этого в колбу помещают такой же объем экстракта, как для определения АК, прибавляют равный ему объем ацетатного буферного раствора с рН 4,0, 36 - 40 %-ный раствор формальдегида в объеме, равном половине объема буферного раствора, перемешивают и выдерживают в течение 10 мин, закрыв предварительно колбу пробкой. Затем содержимое титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений и не менее, чем с двумя различными навесками, различающимися не более, чем на 10 %. Чувствительность визуального титрования составляет 5 мкг/см³.

5.2 Определение витамина С в образцах, дающих окрашенные экстракты

Флуориметрический метод определения

Этот метод рассмотрен в «Руководстве по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов», 1998 г.

Метод индофенол-ксилолъной экстракции

Этот метод рассмотрен в сборнике научных трудов «Теоретические и клинические аспекты науки о питании» т. VIII, 1987, с. 178 - 180.

Колориметрический анализ АК в водной среде

Приготовление экстракта и реактивов см. в п. 5.2.

Проведение анализа. Готовят растворы в следующей последовательности (табл. 21).

Таблица 21

Последовательность добавления реагентов в колориметрическом методе

При экстракции 2 % НСl на анализ берут по 5 см³ ацетатного буфера.

При большой концентрации АК или интенсивной окраске экстракта берут меньше 5 см³ экстракта, добавляя в растворы № 3 и 3* количество экстрагирующего агента равное 5 см³ минус объем пробы. Измеряют поглощение фенолята (избытка) в пробах № 1 - 3 при l = 540 нм.

Содержание АК (X), выраженное в мг на 100 г исследуемого образца рассчитывают по формуле:

, где

К - количество АК в 0,5 см³ стандартного раствора, взятого на определение, мг;

 - поглощение фенолята в контрольном растворе (№ 1) против поглощения фенолята в растворе стандарта (№ 2);

 - поглощение фенолята в контрольном растворе № 1 (кювета сравнения - раствор № 1*);

 - поглощение фенолята в растворе экстракта № 3 (кювета сравнения - раствор № 3*);

остальные обозначения приведены выше.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух определений

5.3. Спектрофотометрическое определение витамина С в напитках

Проведение анализа

После дегазации и, если необходимо, фильтрования исследуемых напитков готовят три раствора, добавляя реагенты в следующей последовательности (табл. 22).

Таблица 22

Последовательность добавления реагентов при спектрофотометрическом определении витамина С

Измеряют поглощение фенолята (избытка) в пробах № 2 - 3 при l = 540 нм.

Содержание АК (X), выраженное в мг на 1 л напитка рассчитывают по формуле:

, где

K - количество АК в 0,5 см³ стандартного раствора, взятого на определение, мг;

 - величина поглощения исследуемого раствора № 3 против поглощения фенолята в контроле на реактивы;

 - общий объем исследуемого напитка, обычно его принимают равным 1000 см³;

 - величина поглощения стандартного раствора № 2 против поглощения фенолята в контроле на реактивы;

V_np - объем исследуемого напитка, взятый для спектрофотометрирования, в данном случае - 0,5 см³.

За окончательный результат определения принимают среднее арифметическое двух определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 3 % от среднего арифметического.

Чувствительность - 3 мкг АК в пробе.

Для одной партии буфера и одного и того же раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия величину (K/D_1-2), характеризующую качество реактива Тильманса, можно определять один раз в течение одной - двух недель, считая ее постоянной.

5.4. Потенциометрическое титрование

Этот метод описан в «Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов», 1998.

Приложение 1

Некоторые физико-химические свойства витаминов

Аскорбиновая кислота

Белые кристаллы. Устойчива в твердом состоянии. Водные растворы имеют рН 3. Водные растворы устойчивы только в отсутствие кислорода, на воздухе устойчивы при рН 5 - 6, очень неустойчивы при щелочных рН. Окисление катализируют Сu, Fe. Хорошо растворима в воде - 33,3 г в 100 см³ при комнатной температуре.

Тиаминхлорид гидрохлорид

Белые кристаллы. Гигроскопичен. Устойчив в твердом состоянии на воздухе. Водные растворы при рН > 5 не устойчивы к нагреванию, при рН > 7,0 не устойчивы при комнатной температуре. Хорошо растворим в воде - 100 г в 100 см³ при комнатной температуре.

Рибофлавин

Желтые кристаллы. Сухое твердое вещество устойчиво к рассеянному свету. Чрезвычайно фотолабилен в растворах, особенно щелочных. Нейтральные и кислые водные растворы устойчивы в темноте, за 1 мес. разлагается 3 % при 27 °С и рН 6,0. Быстро разлагается в щелочных растворах. Мало растворим в воде - 0,01 г в 100 см³ при 25 °С и 0,23 г в 100 см³ при 100 °С. Растворимость в кислых растворах: в 3 %-ной соляной кислоте при 15 °С - 0,026 %.

Пиридоксингидрохлорид

Белые кристаллы. Устойчив в твердом состоянии на свету. Нейтральные и щелочные растворы фотолабильны. Хорошо растворим в воде - 22 г в 100 см³ при комнатной температуре.

a-токоферол

Светло-желтые масла. Хорошо растворим в этаноле. Медленно окисляется на воздухе, быстро - в присутствии щелочи или при нагревании. Устойчив к действию кислот (до 100 °С). Постепенно темнеет на свету, чувствителен к УФ-свету.

a-токоферилацетат

Желтые кристаллы. Эфиры (ацетат и др.) гораздо более устойчивы к свету и кислороду.

Ретинол

Желтые кристаллы. Легко окисляется на воздухе. Разрушается под действием УФ-света. Устойчив в щелочной среде, неустойчив - в кислой. Хорошо растворим в этаноле.

b-каротин

Темно-фиолетовые кристаллы. Окисляется на воздухе, фотолабилен. Растворим в этаноле.

Приложение 2

Определение концентрации растворов витаминов, используемых в качестве стандартов

Таблица 23

Коэффициенты молярной экстинкции витаминов для уточнения концентрации стандартных растворов

Таблица 24

Коэффициенты экстинкции 1 %-ных растворов витаминов для уточнения концентрации стандартных растворов

Таблица 25

Уточнение концентрации стандартных растворов витаминов

Концентрацию стандартного раствора витамина (мкг/см³) рассчитывают по формуле:

, где

D - поглощение раствора;

Е - коэффициент молярной экстинкции;

М - молекулярная масса;

V - объем раствора в кювете (3 см³), см³;

V₁ - объем стандартного раствора, взятого на анализ, см³.

Приложение 3

Выделение рибофлавинсвязывающего апобелка из белка куриных яиц

Получение препарата рибофлавинсвязывающего апобелка (РбСБ) проводят при комнатной температуре по компилятивной методике Tillotson J.A., Bashor M.M., White Н.В. с небольшими изменениями.

Реактивы и их приготовление

5 %-ный водный раствор фенола (С₆Н₅ОН).

5 г фенола растворяют при постоянном перемешивании в дистиллированной воде, доводят объем до 100 см³. Фенол относится к 2 классу опасности.

0,1 н. соляная кислота (НСl).

К дистиллированной воде добавляют 0,8 см³ концентрированной (r = 1,19 г/см³) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем доводят до 100 см³.

500 мМ трис-HCl буфер (рН 7,5).

60,5 г трис(гидроксиметил)аминометана (C₄H₁₁NO₃) растворяют в 500 см³ дистиллированной воды, доводят рН до 7,5 потенциометрически с помощью 1 н. соляной кислоты (примерно 400 см³). Объем буфера доводят дистиллированной водой до 1000 см³.

50 мМ трис-HCl буфер (рН 7,5).

Готовят разведением в 10 раз, добавляя к 100 см³ 500 мМ трис-HCl буфер (рН 7,5) дистиллированную воду до 1000 см³.

0,4 М хлорид натрия (NaCl), приготовленный на 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,5).

4,37 г NaCl растворяют в 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,5), доводят объем до 200 см³.

6 мМ соляная кислота (НСl).

К дистиллированной воде добавляют 0,5 см³ концентрированной (r = 1,19 г/см³) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем доводят до 900 см³.

250 мМ Na-ацетатный буфер (рН 3,2).

17 г ацетата натрия (CH₃COONa) растворяют в 100 см³ дистиллированной воды, доводят потенциометрически рН до 3,2 с помощью ледяной уксусной кислоты (плотность 1,05 г/см³), доводят объем дистиллированной водой до объема 500 см³.

25 мМ Na-ацетатный буфер (рН 3,2).

К 100 см³ 250 мМ Na-ацетатного буфера (рН 3,2) добавляют дистиллированную воду, доводят объем до 1000 см³.

25 мМ Na-ацетатный буфер (рН 5,8).

340 мг уксуснокислого натрия (СН₃СООNa) растворяют в 40 см³ дистиллированной воды, доводят потенциометрически рН до 5,8 с помощью ледяной уксусной кислоты (плотность 1,05 г/см³). Доливают дистиллированную воду до объема 100 см³.

Выделение

Белки 2 - 10 свежих куриных яиц гомогенизируют вручную в гомогенизаторе Поттера (стекло-тефлон) до получения массы однородной вязкости. Добавляют сухой NaCl до концентрации 20 % (вес/объем) при постоянном перемешивании механической мешалкой. К полученной суспензии приливают равный объем 5 %-ного водного раствора фенола и центрифугируют 10 мин при 1500 g. С помощью ваты снимают верхнюю пленку. Супернатант желтого цвета диализируют 5 ч против 100 объемов дистиллированной воды (5 - 8 смен) и в течение ночи против 20 объемов 50 мМ трис-НСl (рН 7,5), затем центрифугируют.

Надосадочный раствор наносят на колонку (1,2´7 см) DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia, Швеция), предварительно уравновешенную 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5). После нанесения РбСБ виден в виде желтой зоны в верхней части колонки. Колонку промывают буфером нанесения до тех пор, пока поглощение элюата при 280 нм не становится ниже 0,010. Флавопротеин элюируют 0,4 М NaCl, приготовленным на 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,5). При элюции с колонки собирают визуально видимые ярко окрашенные фракции, содержащие флавопротеин. Фракции флавопротеина в замороженном состоянии при -20 °С могут храниться до 6 мес. Полное отделение рибофлавина от флавопротеина можно проводить двумя способами: диализом против 6 мМ НСl до полного обесцвечивания диализата и хроматографией на колонке КМ-целлюлозы. Для этого элюированные с DEAE-Sephadex A-50 фракции флавопротеина диализируют против 20 объемов 25 мМ Na-ацетатного буфера (рН 3,2) с трехкратной заменой диализирующего буфера в течение 16 ч. Затем наносят на колонку (1´10 см) КМ-целлюлозы (Reanal, Венгрия), предварительно уравновешенную 25 мМ Na-ацетатным буфером (рН 3,2). После нанесения РбСБ также виден на колонке в виде желтой зоны, так как не весь рибофлавин диссоциирован от РбСБ. Для удаления рибофлавина колонку промывают буфером нанесения до полного исчезновения желтой окраски на колонке и уменьшения экстинкции в элюируемом растворе до величины меньше 0,010 при l = 455 нм. Апопротеин элюируют 25 мМ Na-ацетатным буфером (рН 5,8), измеряя поглощение элюата при 280 нм. Фракции с экстинкцией, превышающей 0,1, собирают. Фракции апопротеина, полученные с помощью диализа или хроматографии диализируют против 100 объемов дистиллированной воды в течение ночи, хранят при -20 °С в течение 12 мес. Из белков двух яиц получают 30 - 40 мг апобелка. В лиофилизованном состоянии его активность сохраняется в течение нескольких лет. По данным электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия полученный обоими способами препарат апобелка содержит не менее 80 % пептида с кажущейся молекулярной массой около 36000.

II. Методы определения минеральных веществ

Метод включает подготовку проб и непосредственно проведение количественного определения.

Методы подготовки проб

1.1. Способ сухой минерализации

1.1.1. Способ основан на полном разложении органических веществ путем сжигания пробы в электропечи при контролируемом температурном режиме и предназначен для БАД, кроме содержащих 60 % жира и более.

1.1.2. Подготовка к минерализации

Фарфоровые чашки или тигли после обычной мойки дополнительно обрабатывают раствором уксусной кислоты на кипящей водяной бане в течение 1 ч или промывают горячим раствором азотной кислоты, затем промывают водопроводной водой и ополаскивают дистиллированной водой. Кварцевые чаши и тигли моют раствором азотной кислоты, затем промывают водопроводной и ополаскивают дистиллированной водой.

В чашу (чашку, тигель) в зависимости от определяемого элемента берут навеску продукта из подготовленной к испытаниям пробы, взвешенную с погрешностью 0,01 г при массе навески до 10 г и с погрешностью 0,1 г при массе навески 10 г и более. Масса навески пробы указана в табл. 1 (более подробно см. ГОСТ 26929-94).

1.1.3. Минерализация проб сырья и пищевых продуктов

1.1.3.1. Навеску средней пробы замачивают в 96 % этиловом спирте из расчета 5 см³ спирта на 1 г сухого вещества. Чашки (тигли) с навеской, покрываются часовыми стеклами или чашками Петри, выдерживают при комнатной температуре в течение 12 - 48 ч.

1.1.3.2. Чашки переносят на электроплитку, осторожно высушивают и, постепенно увеличивая нагрев, выдерживают на плитке до начала обугливания.

1.1.3.3. БАД с высоким содержанием сахаров перед обугливанием обрабатывают 20 %-ным раствором серной кислоты из расчета 5 см³ кислоты на 1 г сухого вещества. Далее - по п. 1.1.3.2.

1.1.3.4. Чашки с высушенными пробами помещают в холодную электропечь. Минерализацию проб проводят постепенно, повышая температуру электропечи на 50 °С через каждые 30 мин и доводя ее до 450 °С - продолжают минерализацию при этих условиях до получения серой золы.

Чашу с золой вынимают из электропечи, охлаждают до комнатной температуры и серую золу смачивают водой и 0,5 - 1 см³ раствора азотной кислоты (1:1). Затем кислоту досуха выпаривают на электроплитке со слабым нагревом и снова помещают чашу с пробой в электропечь, постепенно доводя температуру до 300 °С, и выдерживают 0,5 ч. Минерализацию считают законченной, когда зола станет белого или слегка окрашенного цвета, без обугленных частиц. При наличии обугленных частиц повторяют обработку золы раствором азотной кислоты или водой, снова доозоляют.

1.1.4. Полученную золу растворяют при нагревании в азотной кислоте (1:1) из расчета 1 - 5 см³ кислоты на навеску в зависимости от зольности продукта. Раствор выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 %-ной азотной или соляной кислоте до объема 15 - 20 см³.

1.1.5. При неполном растворении золы полученной по п. 1.1.4 азотнокислый раствор с осадком упаривают досуха и перерастворяют в минимальном объеме (5 - 10 см³) соляной кислоты (1:1), снова упаривают до влажных солей. Полученные соли растворяют в 1 % соляной кислоте до объема 15 - 20 см³.

1.1.6. Если растворы золы, полученные по п. 1.1.4 или 1.1.5 содержат нерастворимый осадок, объем растворителя можно довести до 25 - 30 см³, пробу подогреть до растворения. Если и в этом случае полного растворения не наблюдается, раствор отфильтровывают через промытый растворителем фильтр и осадок отбрасывают.

1.2. Способ мокрой минерализации

1.2.1. Способ основан на полном разрушении органических веществ пробы при нагревании с серной и азотной концентрированными кислотами с добавлением перекиси водорода и предназначен для всех видов БАД, кроме содержащих сливочное масло и животные жиры.

1.2.2. Подготовка к минерализации

1.2.2.1. Стеклянную посуду после обычной мойки дополнительно промывают раствором азотной кислоты, ополаскивают водопроводной, а затем дистиллированной водой.

1.2.2.2. Навеску жидких и пюреобразных БАД по п. 1.2.2 взвешивают в стакане, переносят в колбу Кьельдаля или плоскодонную колбу, стараясь не попасть на стенки колбы.

1.2.2.3. Навеску БАД по п. 1.2.2 берут на обеззоленный фильтр, заворачивают в него и стеклянной палочкой помещают на дно колбы Кьельдаля или плоскодонной колбы.

1.2.2.4. Навеску сухих БАД (желатиноподобных) помещают в колбу Кьельдаля, добавляют 15 см³ воды, перемешивают. Желатин затем оставляют на 1 ч для набухания.

1.2.3. Минерализация проб сырья и продуктов

1.2.3.1. Кислотная минерализация проб сырья и продуктов, кроме растительного масла, маргарина, пищевых жиров

В колбу с пробой БАД, подготовленной к минерализации по п. 1.2.2, вносят азотную кислоту из расчета 10 см³ на каждые 5 г продукта и выдерживают не менее 15 мин. Затем в колбу вносят 2 - 3 стеклянных шарика для равномерности кипения, закрывают грушевидной пробкой и начинают нагревать на электроплитке слабо, затем сильнее, упаривая содержимое колбы до объема 3 - 5 см³.

Колбу охлаждают, вносят 10 см³ азотной кислоты, содержимое упаривают до объема 5 см³, после чего охлаждают. Эту процедуру повторяют 2 - 4 раза.

В колбу вносят 10 см³ азотной кислоты, 2 см³ серной кислоты, 2 см³ перекиси водорода из расчета на каждые 5 г образца. Минерализацию БАД на молочной основе проводят без добавления серной кислоты. Содержимое колбы упаривают до объема 5 см³, не допуская образования коричневой окраски жидкости. При появлении коричневой окраски нагревание прекращают.

Колбу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 5 см³ азотной кислоты и 2 см³ перекиси водорода и снова нагревают до появления белых паров серного ангидрида. Если при этом раствор не обесцветился, эту процедуру повторяют. Минерализацию считают законченной, если раствор после охлаждения остается бесцветным.

Для удаления остатков кислот в охлажденную колбу добавляют 10 см³ воды и кипятят 10 мин с момента выделения белых паров, затем охлаждают. Добавление воды и нагревание повторяют еще 2 раза.

Если при этом образуется осадок, в колбу вносят 20 см³ дистиллированной воды, 2 см³ серной кислоты, 5 см³ соляной кислоты и кипятят до растворения осадка, постоянно дополняя испаряющуюся воду. Полученный минерализат после охлаждения используют для анализа полностью или количественно переносят водой в мерную колбу вместимостью 50 см³, доводят до метки водой и перемешивают.

1.2.3.2. Кислотная минерализация проб с высоким содержанием жира

Исследуемую пробу в колбе Кьельдаля, подготовленную к минерализации по п. 1.2.2, нагревают на электроплитке 7 - 8 ч до образования вязкой массы, охлаждают, добавляют 25 см³ азотной кислоты и вновь осторожно нагревают, избегая бурного вспенивания. После прекращения вспенивания колбу с содержимым охлаждают, добавляют еще 25 см³ азотной кислоты и 12 см³ хлорной кислоты и нагревают до получения бесцветной жидкости. Если во время сжигания жидкость темнеет, то к ней добавляют периодически по 5 см³ азотной кислоты и продолжают нагревание до завершения минерализации. Минерализации. Минерализацию считают законченной, если раствор после охлаждения остается бесцветным. Затем продолжают процедуру по п. 1.2.3.1.

1.3. Способ кислотной экстракции (неполной минерализации)

1.3.1. Способ основан на экстракции элементов из пробы продукта кипячением с разбавленной соляной или азотной кислотой и предназначен для жиросодержащих БАД.

1.3.2. Экстракция и подготовка экстрактов к анализу

1.3.2.1. Экстракция проб БАД

В термостойкую колбу с навеской образца, отобранного по п. 1.2.2, вносят цилиндром 40 см раствора соляной кислоты (1:1) и такой же объем раствора азотной кислоты (1:2).

В колбу добавляют несколько стеклянных шариков, вставляют в нее холодильник, помещают на электроплитку, покрытую асбестом, и кипятят в течение 1,5 ч с момента закипания. Затем содержимое колбы медленно охлаждают до комнатной температуры, не вынимая холодильника.

В колбу с экстракционной смесью жиросодержащих БАД с кислотой помещают в холодную водяную баню для затвердевания жира. Затвердевший жир прокалывают стеклянной палочкой, фильтруют через фильтр, смоченный кислотой, затем промывают фильтр 5 - 7 см³ дистиллированной водой. Оставшийся в колбе жир расплавляют на водяной бане, добавляют 10 см³ раствора кислоты, встряхивают, охлаждают, после охлаждения жир прокалывают и промывную жидкость сливают в тот же сосуд через тот же фильтр, затем фильтр промывают 5 - 7 см³ дистиллированной воды.

Экстракционную смесь масла с кислотой переносят в делительную воронку. Колбу ополаскивают 10 см³ кислоты, которую сливают в ту же воронку. После разделения слоев нижний водный слой сливают через фильтр, смоченный кислотой, в кварцевую или фарфоровую чашку, затем фильтр промывают 5 - 7 см³ дистиллированной воды.

Чашу с экстракционной смесью осторожно выпаривают и обугливают на электроплитке. Затем помещают в электропечь и озоляют до исчезновения обугленных частиц.

1. Атомно-абсорбционный метод определения содержания натрия, калия, кальция, магния, железа, марганца, меди, цинка, свинца, кадмия, кобальта, никеля, хрома

Сущность метода

Метод основан на распылении раствора минерализата испытуемой пробы в воздушно-ацетиленовом пламени. Металлы, находящиеся в растворе минерализата, попадая в пламя, переходят в атомное состояние. Величина адсорбции света с длиной волны соответствующей резонансной линии, пропорциональна значению концентрации металла в испытуемой пробе.

Контрольный (холостой) опыт

При проведении деструкции проб любым способом обязательно проведение контрольного (холостого) опыта для учета уровня загрязнений, которые могут возникнуть на любой стадии подготовки проб. В каждой подготавливаемой серии проб контрольный тигель (чашка, стакан и пр.) обязательно проводят через все стадии подготовки вместе с тиглями, содержащими навески БАД, при одинаковом времени нахождения на электроплитке, в муфеле, при использовании тех же реактивов в том же количестве, той же мерной посуды и т.д. Полученный в холостом опыте раствор анализируют в той же серии измерений, что и растворы проб. Если пробы БАД обычно анализируют в двух повторностях, то контрольный опыт также целесообразно проводить в двух повторностях.

Подготовка к испытанию

Приготовление растворов

Определение содержания элементов в испытуемых растворах проводят методом градуировочного графика, который строится по значениям сигналов абсорбции растворов сравнения.

Головные стандартные растворы (эталоны) готовят из чистых металлов (более 99,9 %) или чистых (х.ч., ос.ч.) устойчивых соединений элементов при использовании растворителей, обеспечивающих устойчивость растворов при хранении (допускается использование коммерческих растворов). Концентрация металла в головном растворе должна быть равна 1 г/дм³ (1000 мкг/см³) (табл. 26). Срок их хранения обычно не превышает 2 - 3 лет, если растворы хранятся в герметичной посуде из стекла твердых сортов, полиэтилена высокой плотности, полистирола, кварца, т.е. материалов, наименее склонных к ионному обмену и абсорбции. Разбавленные растворы с концентрацией порядка 100 мкг/см³ обычно могут храниться до 1 мес, с концентрацией 10 мкг/см³ - 2 - 3 дня. Необходимо избегать применения резиновых пробок, которые могут быть источником загрязнения для ряда микроэлементов, а также избегать хранения растворов в местах, куда попадает прямой солнечный свет. Для приготовления головных стандартных растворов не рекомендуется использовать кристаллогидраты, которые могут не отвечать предполагаемому составу, и нестойкие реактивы, например перманганат калия.

Стандартные растворы сравнения (рабочие эталоны) готовят путем разбавления головных стандартных растворов до концентрации, которая должна соответствовать рабочему диапазону концентраций и быть близка к концентрации элемента в анализируемом растворе. Разбавление производят тем же бланковым раствором, который применяется для приготовления анализируемых растворов проб.

Обычно для построения градуировочного графика в области рабочих концентраций достаточно 3 - 5 растворов сравнения, при работе в линейной области - 2 раствора. При большой и особенно знакопеременной кривизне градуировочного графика необходимо увеличивать число стандартных растворов сравнения или ограничивать область рабочих концентраций более узким диапазоном (табл. 27).

Приготовление растворов и проб к испытанию

Раствор золы может анализироваться непосредственно или после дополнительной подготовки, которая необходима в следующих случаях.

а) Концентрация элемента в растворе значительно превышает верхний предел интервала рабочих концентраций. Производят разбавление исходного раствора бланковым раствором до необходимого уровня концентрации.

б) Концентрация элемента в исходном растворе ниже предела его обнаружения. Если необходима количественная, а не односторонняя («не более»...) оценка, производят концентрирование элемента методом экстракции. Экстракция применяют также при определении микроэлементов на приборах, которые не имеют автоматической коррекции неселективного поглощения.

Для проведения экстракции рассматриваемых элементов могут быть применены разнообразные экстракционные системы, в частности, система диэтилдитиокарбамат натрия (или аммония) - n-бутилацетат (или метилизобутилкетон). Эти системы при регулировании рН позволяют провести экстракцию железа, цинка, меди, марганца, кадмия, свинца, кобальта, никеля и хрома.

Подготовка спектрофотометра к работе и условия измерения

Юстировку прибора проводят в соответствии с технической инструкцией завода (фирмы)-изготовителя. Рекомендуемые условия измерений, а также значения предела определения по данным авторов методики приведены в табл. 27.

Альтернативные длины волн резонансных линий натрия и калия, указанные в табл. 27, могут использоваться для определения в разных областях концентраций, если позволяют технические характеристики лампы и прибора. Для свинца и хрома измерение на указанных альтернативных линиях может отличаться не только чувствительностью, но и отношением сигнал/шум, скоростью дрейфа сигнала. Поэтому выбор резонансной линии в этих случаях проводится для каждого прибора после предварительных сравнительных испытаний.

Указанные в табл. 27 номинальные значения ширины щели монохроматора отвечают отсутствию перекрывания резонансной полосы поглощения с соседними линиями спектра. Тем не менее настройку монохроматора по максимуму излучения источника рекомендуется проводить при минимально возможной щели. Измерения абсорбции таких элементов, как железо, свинец, кадмий, кобальт, никель и хром, при концентрациях, близких к пределу обнаружения, могут проводиться при максимальной щели монохроматора, если для данного прибора это дает улучшение отношения сигнал/шум.

Таблица 26

Рекомендуемые способы приготовления головных стандартных растворов, концентрация металла - 1000 мкг/см³

Таблица 27

Условия атомно-абсорбционных измерений в воздушно-ацетиленовом пламени

Три вида воздушно-ацетиленового пламени, указанные в табл. 27, устанавливают приближенно и, как правило, визуально. Восстановительное пламя соответствует соотношению потоков воздух/ацетилен (примерно 4:1), при котором появляется слабое белесое свечение в нижней части факела. Окислительное пламя требует вдвое меньшего расхода ацетилена при том же воздушном потоке. Стехиометрическим пламенем считается промежуточный вариант. При определении микроэлементов, особенно кобальта, никеля и хрома условия измерения могут быть дополнительно улучшены при юстировке соотношения газов и высоты горелки до получения максимального сигнала поглощения (с учетом смещения нулевой линии).

Предел определения соответствовал тройному стандартному отклонению шума измеряемого сигнала прибора у авторов методики.

Особенности определения отдельных элементов

Натрий и калий

Может измеряться как абсорбция, так и эмиссия этих элементов.

В отличие от атомно-абсорбционного измерения эмиссия натрия при длине волны дублетной линии 589 нм может давать завышенные результаты вследствие наложения излучения кальция. Поэтому при атомно-эмиссионных измерениях натрия подготовка проб должна включать отделение кальция посредством осаждения его оксалатом аммония.

При концентрациях калия менее 100 мкг/см³ необходимо согласовывать примерное соотношение калия и натрия в пробах и смешанных растворах сравнения. Это соотношение может устанавливаться как на основе ожидаемых результатов, так и путем предварительных приближенных определений. При концентрациях калия более 100 мкг/см³ влиянием натрия можно пренебречь.

Кальций

Бланковый раствор, растворы проб и растворы сравнения должны содержать 0,5 % стронция (в расчете на металл) в виде хлорида.

Железо и цинк

Растворы проб для анализа во многих случаях требуют разбавления, которое уменьшает межэлементные и матричные влияния. Превышение границ диапазона рабочих концентраций, указанных в табл. 26, может дать смещенные результаты.

Проведение измерений и обработка результатов

Измерения проводят в соответствии с технической инструкцией, прилагаемой к прибору, с учетом следующих особенностей. Потенциальная возможность появления дрейфа или измерения чувствительности вследствие частичного засорения системы распылителя в процессе работы требует более или менее частого контроля, т.е. проведения повторных градуировок. Частота переградуировок определяется скоростью дрейфа и требованиями точности. При отсутствии дрейфа или для кратковременной серии измерений достаточно проведения двух градуировок - в начале и в конце измерений. В других случаях целесообразно проводить измерения по следующей схеме: 1-я градуировка - 1-я серия замеров абсорбции 5 - 10 анализируемых растворов - 2-я градуировка - 2-я серия замеров абсорбции тех же растворов в обратном порядке - 3-я градуировка. Результаты, полученные в двух сериях, усредняют.

Таблица 28

Метрологические характеристики унифицированных атомно-абсорбционных методов анализа БАД

Обработка результатов

Пересчет концентрации элемента в растворе (С, мкг/см³) на содержание его в БАД (X, мг/кг) проводят по формуле:

, где

С_к - уровень загрязнения в контрольном опыте, мкг/см³;

K - коэффициент разбавления или концентрирования исходного раствора пробы, равный отношению объема анализировавшегося раствора к объему аликвоты, взятой для разбавления или концентрирования;

Y - объем исходного раствора пробы, см³;

Y_к - объем раствора в контрольном опыте, см³;

Р - навеска пробы, г.

Метрологические характеристики

Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории (r) и е допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях (R), а также внутрилабораторное среднеквадратичное отклонение (s_r) и межлабораторное среднеквадратичное отклонение (S_R) приведены в табл. 28, где X - средний уровень концентрации элемента в продукте, мг/кг; а, в - безразмерные эмпирические коэффициенты.

2. Молибдено-ванадиевый метод определения фосфора

Метод предназначен для определения массовой доли фосфора в БАД основан на образовании желтого фосфорно-молибдено-ванадиевого комплекса. Метод заключается в сухой минерализации пробы, растворении золы, проведении цветной реакции с молибдено-ванадиевым реактивом и измерении интенсивности желтого окрашивания раствора.

1. Аппаратура, реактивы и материалы

Калий фосфорнокислый однозамещенный, х.ч., по ГОСТ 4198.

Аммоний ванадиевокислый, мета, х.ч., по ГОСТ 9336.

Аммоний молибденовокислый, ч.д.а., по ГОСТ 3765.

2. Подготовка к испытанию

2.1. Приготовление раствора соляной кислоты с массовой концентрацией 25 г/дм³

В мерную колбу вместимостью 1 дм³ вносят 67,4 см³ концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают.

2.2. Приготовление основного стандартного раствора фосфора с массовой концентрацией 1 г/дм³

Раствор готовят по ГОСТ 4212.

Раствор готовят из калия фосфорнокислого однозамещенного, предварительно высушенного до постоянной массы в сушильном шкафу при 104 °С или в эксикаторе над концентрированной серной кислотой. Навеску 4,3930 г КH₂РО₄ взвешенную с погрешностью не более 0,001 г, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1 дм³, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой и перемешивают.

2.3. Приготовление раствора аммония ванадиевокислого с массовой концентрацией 2,5 г/дм³ (раствор А)

2,5 г аммония ванадиевокислого растворяют в мерной посуде вместимостью 1 дм³ в 500 см³ кипящей дистиллированной воды. После охлаждения раствора до комнатной температуры в него вносят 20 см³ концентрированной азотной кислоты. Объем раствора доводят до 1 дм³ дистиллированной водой, перемешивают.

2.4. Приготовление раствора аммония молибденовокислого с массовой концентрацией 100 г/дм³ (раствор Б)

100 г аммония молибденовокислого растворяют в мерной посуде вместимостью 1 дм³ в 500 см³ дистиллированной воды, подогретой до 50 °С. Раствор охлаждают до комнатной температуры, затем осторожно при перемешивании стеклянной палочкой вносят 100 см³ концентрированной серной кислоты. Перемешивание продолжают до достижения раствором комнатной температуры, доводят его объем до 1 дм³ дистиллированной водой, перемешивают.

2.5. Приготовление молибдено-ванадиевого реактива

Реактив готовят смешиванием равных объемов растворов А и Б. Составной реактив годен в течение месяца.

2.6. Минерализация

Минерализацию проводят сухим способом по ГОСТ 26929-86.

Рекомендуемые величины массы навески указаны в табл. 29.

Таблица 29

Масса навески БАД при определении массовой доли фосфора

2.7. Измерения проводят на спектрофотометре в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 10 мм при длине волны 436 нм или на фотоэлектроколориметре в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 20 мм со светофильтром l = 440,5 нм.

2.8. Приготовление растворов сравнения

2.8.1. В мерную колбу вместимостью 50 см³ вносят 5 см³ основного стандартного раствора фосфора с массовой концентрацией 1 г/дм³, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают. Раствор готовят в день построения градуировочного графика.

2.8.2. При проведении измерений на спектрофотометре в мерные колбы вместимостью 50 см³ вносят 1, 2, 3, 4, 5, 6 см³ рабочего стандартного раствора фосфора, приготовленного по п. 2.8.1, соответственно 100, 200, 300, 400, 500 и 600 мкг фосфора, добавляют воду до объема 10 см³. В каждую колбу вносят 10 см³ разбавленной (1:9) серной кислоты, 10 см³ составного молибдено-ванадиевого реактива, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают.

2.8.3. При проведении измерений на фотоэлектроколориметре в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 20 мм в мерные колбы вместимостью 50 см³ вносят 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 см³ рабочего стандартного раствора фосфора, приготовленного по п. 3.8.1, соответственно 50, 100, 150, 200, 250 и 300 мкг фосфора, и далее по п. 2.8.2.

2.8.4. Растворы выдерживают 30 мин при температуре 20 - 30 °С и измеряют оптическую плотность против контрольного раствора.

2.8.5. Построение аналитического градуировочного графика

Градуировочный график строят, откладывая на оси абсцисс введенные в растворы сравнения массы фосфора в мкг, на оси ординат - соответствующие им значения оптической плотности.

3. Проведение испытания

3.1. Золу, полученную по п. 2.6, растворяют в 5 см³ раствора соляной кислоты (1 + 1) при нагревании на кипящей водяной бане и раствор упаривают до влажных солей, к осадку в тигле добавляют 20 см³ раствора соляной кислоты (25 г/дм³) и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 - 10 мин. После охлаждения содержимое тигля количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³ и доводят до метки раствором соляной кислоты 25 г/дм³. Раствор перемешивают.

3.2. В мерную колбу вместимостью 50 см³ помещают аликвотный объем от 1 до 4 см³ раствора, приготовленного по п. 3.1, добавляют воду до объема 10 см³, 10 см³ разбавленной (1:9) серной кислоты, 10 см³ составного молибдено-ванадиевого реактива, доводят объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешивают.

Оптическую плотность раствора измеряют по п. 2.8.4.

3.3. По полученному значению оптической плотности с помощью градуировочного графика находят массу фосфора, содержащуюся в аликвотном объеме минерализата.

4. Обработка результатов

4.1. Массовую долю фосфора в мг/100 г вычисляют по формуле:

, где

т - масса фосфора, найденная по градуировочному графику, мкг;

V - общий объем минерализата, см³;

V₁ - аликвотный объем минерализата, взятый для испытания, см³;

10 - коэффициент пересчета в мг/100 г;

М - навеска образца, г.

4.2. Результаты определений рассчитывают до третьей значащей цифры.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.

4.3. Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), приведены в табл. 30.

Таблица 30

Относительные допустимые внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения результатов определения

3. Комплексонометрический метод определения кальция и магния

Метод предназначен для определения массовой доли кальция и магния в БАД основан на образовании в щелочной среде малодиссоциированных комплексных соединений катионов кальция и магния с динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б). При рН 12 - 13,5 образуются комплексные соединения кальция, при рН 10,0 - кальция и магния. Метод заключается в сухой минерализации пробы при 450 °С, растворении золы, титровании раствора золы раствором трилона Б в присутствии индикатора кислотного хромового темно-синего.

1. Специфические реактивы

Индикатор хромовый темно-синий кислотный по ТУ 6-09-3870, 5 г/дм³ в растворе этилового спирта (1:5).

Индикатор метилрот по ГОСТ 5853, 1 г/дм³ в растворе этилового спирта (5:3).

Гидроксиламин солянокислый по ГОСТ 5459, х.ч., раствор 100 г/дм³.

Калия или натрия гидроокись по ГОСТ 24363 и ГОСТ 4328, соответственно, х.ч., раствор 200 г/дм³.

Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч., раствор 25 г/дм³ и разбавленная (1:1).

Натрий сернистый по ГОСТ 2053, ч.д.а., раствор 20 г/дм³.

Натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280, х.ч., раствор 100 г/дм³.

Соль динатриевая этилендиаминтетрауксусной кислоты двуводная (трилон Б) по ГОСТ 10652, х.ч., или стандарт-титр.

2. Подготовка к испытанию

2.1. Приготовление растворов для проведения испытания

2.1.1. Приготовление основного раствора кальция с молярной концентрацией 0,01 моль/дм³. Кальций углекислый высушивают до постоянной массы при 100 - 105 °С. Навеску соли 1,009 г, взвешенную с погрешностью не более 0,0002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, приливают 20 см³ концентрированной соляной кислоты, доводят объем раствора до 1000 см³ водой, тщательно перемешивают.

2.1.2. Приготовление буферного раствора с рН 10,0

20 г хлористого аммония растворяют в небольшом количестве воды, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³, приливают 80 см³ аммиака 250 г/дм³, доводят объем раствора до 1000 см³.

2.1.3. Приготовление раствора трилона Б с молярной концентрацией 0,01 моль/дм³

Раствор трилона Б готовят из стандарт-титра. При отсутствии стандарт-титра навеску 3,72 г трилона Б, взвешенную с погрешностью не более 0,01 г, помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, растворяют в воде, доводят объем раствора до 1000 см³ бидистиллированной водой, перемешивают. Мутный раствор фильтруют. Срок хранения 6 мес.

2.1.4. Определение точной концентрации раствора трилона Б

Пипеткой отбирают 10 см³ основного раствора кальция в коническую колбу вместимостью 100 см³. Вносят 5 - 10 капель индикатора кислотного хромового темно-синего и 6 см³ раствора гидроокиси натрия с массовой концентрацией 200 г/дм³. Быстро титруют из бюретки раствором трилона Б до перехода окраски из малиново-фиолетовой в синюю, не исчезающую в течение 1 мин. Молярную концентрацию раствора трилона Б рассчитывают по формуле:

, где

С - молярная концентрация раствора трилона Б, моль/дм³;

0,01 - молярная концентрация стандартного раствора кальция, моль/дм³;

10 - объем стандартного раствора кальция, взятый для титрования, см³;

V - объем раствора трилона Б, израсходованный на титрование, см³.

2.2. Минерализация

2.2.1. Минерализацию сухим способом проводят по ГОСТ 26929-86.

2.2.2. В табл. 31 указаны рекомендуемые величины массы навесок для некоторых продуктов.

3. Проведение испытаний

3.1. К золе, полученной по п. 2.2, добавляют 20 см³ раствора соляной кислоты с массовой концентрацией 250 г/дм³ и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 - 10 мин до полного растворения золы, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, доводят объем до метки бидистиллированной водой, перемешивают.

3.2. Перед проведением анализа необходимо приготовить микробюретку для титрования.

3.3. Определение массовой доли кальция

3.3.1. В коническую колбу вместимостью 100 см³ помещают аликвотный объем раствора золы, равный 10 см³, добавляют 3 см³ раствора гидроксиламина и 3 см³ раствора натрия лимоннокислого. Вносят 5 - 10 капель индикатора кислотного хромового темно-синего. Приливают 6 см³ раствора гидроокиси с массовой концентрацией 200 г/дм³ и тотчас быстро титруют раствором трилона Б до перехода окраски из малиново-фиолетовой в синюю, сравнивая с оттитрованной контрольной пробой.

Таблица 31

Масса навески БАД при определении массовой доли кальция и магния

3.3.2. В конце титрования замечают объем трилона Б, пошедшего на титрование, и прибавляют еще каплю трилона. Если окраска раствора не меняется, титрование считают законченным.

3.3.3. Во время титрования можно ориентироваться на синий ореол, образующийся в месте падения капли трилона. Титрование считают законченным, если синий ореол больше не образуется.

3.3.4. Окраску раствора необходимо смотреть на фоне белого экрана. Окраска оттитрованного раствора устойчива длительное время.

3.3.5. Перед определением кальция оттитровывают контрольную пробу, которую готовят по п. 3.3.1, но вместо раствора золы приливают 4 см³ соляной кислоты с массовой концентрацией 25 г/дм³.

3.3.6. В том случае, если на титрование аликвоты раствора золы уходит больше 3 см³ трилона либо конец титрования затягивается, испытуемый раствор следует разбавить.

3.3.7. Если на титрование уходит меньше 0,5 см³ трилона Б, необходимо увеличить массу навески анализируемой БАД либо аликвотный объем, взятый для анализа. Можно уменьшить концентрацию трилона, разбавив его в 2 раза.

3.4. Определение массовой доли магния

3.4.1. Другие 10 см³ раствора золы, в которых определяют сумму кальция и магния, помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³, вносят 1 - 2 капли метилрота и нейтрализуют из бюретки гидроокисью натрия с массовой концентрацией 50 г/дм³. Добавляют 0,5 см³ раствора сернистого натрия, разбавляют водой до 100 см³, добавляют 5 см³ буферного раствора. рН полученного раствора равен 10,0. Вносят 5 - 10 капель индикатора кислотного хромового темно-синего и медленно титруют трилоном Б до устойчивой голубой окраски, сравнивая с оттитрованной контрольной пробой. При титровании раствор интенсивно перемешивают. Замечают объем, пошедший на титрование, прибавляют еще несколько капель трилона Б. Если окраска не меняется, титрование считают законченным.

3.4.2. Перед определением магния оттитровывают контрольную пробу, которую готовят по п. 3.4.1, но вместо раствора золы приливают 4 см³ соляной кислоты с массовой концентрацией 25 г/дм³.

3.4.3. Объем трилона Б, пошедший на титрование магния, определяют по разности объемов трилона, пошедшего на титрование, суммы кальция и магния и одного кальция.

Примечание. Метод неприменим для определения массовой доли магния в БАД, в которых массовая доля кальция в 20 раз и более превышает массовую долю магния.

4. Обработка результатов

4.1. Массовую долю кальция (X₁) в % вычисляют по формуле:

, где

С - молярная концентрация раствора трилона Б, моль/дм³;

 - объем исходного раствора золы, см³;

V₁ - объем раствора трилона Б, израсходованный на титрование контрольной пробы, см³;

V₂ - объем раствора трилона Б, израсходованный на титрование кальция, см³;

V₃ - объем исследуемого раствора, взятый для титрования, см³;

т - навеска БАД, г;

100 - коэффициент пересчета в 100 г образца;

40,08 - атомная масса кальция, г.

4.2. Массовую долю магния (X₂) в % вычисляют по формуле:

, где

V₄ - объем раствора трилона Б, израсходованный на титрование контрольной пробы, см³;

V₅ - объем раствора трилона Б, израсходованный на титрование суммы кальция и магния, см³;

24,305 - атомная масса магния, г;

остальные обозначения те же, что и в формуле (1).

4.3. Вычисления проводят до первого десятичного знака и округляют до целого числа. Минимальная массовая доля кальция, определяемая данным методом в аликвотном объеме минерализата, составляет 10 мкг. Минимальная массовая доля магния, определяемая данным методом в аликвотном объеме минерализата, составляет 6 мкг.

4.4 Метрологические характеристики

Относительно допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднеарифметическому значению Rr, и относительно допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднеарифметическому значению RR в зависимости от содержания Са и Mg в продукте приведены в табл. 32.

Таблица 32

Относительно допустимые внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения результатов определения

4. Определение свинца и кадмия методом инверсионной вольтамперометрии

Метод основан на использовании инверсионной вольтамперометрии.

Специфические аппаратура, материалы и реактивы

Полярограф марки ПЛС-1 или аналогичный по техническим характеристикам.

Азот газообразный по ГОСТу 9293-74, о.ч., или «0», или другой инертный газ с массовой долей кислорода не более 0,001 %.

Кадмий, ч.д.а.

Дитизон по ГОСТ 10165-79, ч.д.а., растворы в хлороформе 0,01; 0,30 г/дм³.

Кислота азотная, о.ч., по ГОСТ 11135-78 или кислота азотная, х.ч., по ГОСТ 4461-77, плотностью 1,40 г/см³ и разбавленная бидистиллированной водой (1 + 1) и (1 + 2).

Кислота соляная, о.ч., по ГОСТ 14261-77 или кислота соляная по ГОСТ 3118-77, плотностью 1,19 г/см³, разбавленные бидистиллированной водой растворы НСl концентрации 2,0 и 0,1 моль/дм³.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч.д.а., гранулированная и раствор NaOH, 0,02 моль/дм³.

Пирогаллол А по ГОСТ 6408-75, ч.д.а., раствор 250 г/дм³.

Ртуть по ГОСТ 4658-73, РО или PI.

Свинец азотнокислый, х.ч., по ГОСТ 4236-77.

Подготовка к испытанию

Подготовка проб

Подготовку проб и минерализацию БАД путем сухого озоления проводят по ГОСТу 26926-86.

Подготовка лабораторной посуды

Лабораторную стеклянную посуду промывают хромовой смесью, водой, азотной кислотой плотностью 1,4 г/см³, несколько раз дистиллированной и дважды бидистиллированной водой и высушивают. Затем промывают раствором дитизона 0,01 г/дм³. Даже при незначительном изменении окраски проводят несколько раз обработку дитизоном: заполняют посуду раствором дитизона 0,30 г/дм³ и выдерживают каждый раз по 30 мин, после чего промывают хлороформом и повторяют обработку, используя раствор дитизона 0,01 г/дм³. Промывают хлороформом и высушивают на воздухе в вытяжном шкафу.

Очистка инертного газа от кислорода

При наличии примеси кислорода более 0,001 % газ пропускают через поглотительную смесь, состоящую из растворов пирогаллола и гидроокиси натрия в соотношении 1:5.

Приготовление основного раствора кадмия

Основной раствор кадмия готовят следующим образом: 1,000 г металлического кадмия помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³ и растворяют при нагревании на электроплитке в 25 см³ разбавленной (1:1) азотной кислоты. Раствор выпаривают на электроплитке со слабым нагревом до объема 3 см³, приливают 15 см³ соляной кислоты плотностью 19 г/см³ и вновь выпаривают до того же объема. Выпаривание повторяют еще раза два, добавляя каждый раз по 5 см³ соляной кислоты. После охлаждения добавляют 50 см³ соляной кислоты плотностью 1,19 г/см³, количественно переносят раствор в мерную колбу вместимостью 1000 см³ и доводят бидистиллированной водой до метки. Раствор хранят не более 1 года. Концентрация кадмия в основном растворе равна 1 мг/см³. Стандартные растворы необходимой концентрации готовят последовательным разбавлением в 10, 100 и 1000 раз основного раствора кадмия соляной кислотой 0,1 моль/дм³.

Приготовление основного раствора свинца

Основной раствор свинца готовят следующим образом: свинец азотнокислый перекристаллизовывают и высушивают при 104±1 °С до постоянной массы. 1,599 г высушенной соли растворяют в небольшом объеме бидистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см³. В колбу добавляют 5 см³ азотной кислоты плотностью 1,4 г/см³ и доводят объем раствора до метки бидистиллированной водой. Раствор хранят не более 1 года. Концентрация свинца в основном растворе равна 1 мг/см³. Стандартные растворы необходимой концентрации готовят последовательным разбавлением в 10, 100 и 1000 раз основного раствора свинца соляной кислотой с концентрацией 0,1 моль/дм³.

Приготовление контрольного раствора

Проверяют каждую новую партию реактивов.

Готовят, используя все реактивы и растворы, аналогично приготовлению испытуемого раствора. Если контрольный раствор содержит измеримое количество кадмия или свинца, его готовят ежедневно при каждой серии измерений.

Подготовка капилляра электрода

В стакан электролизера помещают около 20 см³ раствора соляной кислоты 2 моль/дм³ и проводят сначала накопление в течение 60 с, затем растворение при максимальной скорости развертки (10,5´10 mВ/с). Процедуру электрохимической очистки повторяют еще 2 раза. Ячейку многократно промывают бидистиллированной водой.

Приготовление испытуемого раствора

Золу, полученную по ГОСТ 26929-86, растворяют в тигле при нагревании на электроплитке в 5 см³ разбавленной (1:1) соляной кислоты, раствор выпаривают на электроплитке до объема около 1 см³ и затем досуха на водяной бане. Осадок растворяют в 15 см³ раствора соляной кислоты 0,1 моль/дм³ и количественно переносят в стакан электролизера, смывая тигель 5 см³ той же кислоты.

Проведение испытания

Стакан с пробой помещают в гнездо полярографического датчика, опускают в испытуемый раствор подводящую инертный газ или азот трубку и барбатируют раствор в течение 10 - 15 мин, затем конец поднимают, закрепляют над поверхностью раствора и несколько ослабляют ток газа. Записывают первую полярограмму. При этом измерение проводят инверсионной вольтамперометрией в 3 электродном режиме. Накопление проводят при начальном напряжении 1100 мВ, время накопления от 60 до 300 °С в зависимости от концентрации металлов. Полярограмму записывают при напряжении от минус 1100 мВ до 200 мВ, развертка анодная. Детализацию условий измерений осуществляют в соответствии с инструкцией к прибору и спецификой измеряемой пробы. Затем в стакан с используемым раствором вносят добавку - необходимый стандартный раствор в таком количестве, чтобы высота пика кадмия или свинца примерно удвоилась по сравнению с первоначальной. При этом объем добавляемого стандартного раствора должен быть не более 0,5 см³. Снова пропускают через раствор азот, как указано выше, в течение 5 мин. Затем проводят в тех же режимах запись второй полярограммы.

Обработка результатов

Массовую долю кадмия или свинца (X) в мг/кг или массовую концентрацию (мг/дм³) вычисляют по высоте пиков, измеренных на полярограммах с помощью линейки с точностью до 1 мм.

Расчет проводят по формуле:

для массовой доли:

;

для массовой концентрации:

, где

М₁ - масса свинца, добавленного перед вторым полярографированием, мкг;

h₁ - высота пика свинца, полученного при первом полярографировании, мм;

h₂ - высота пика свинца, полученного при втором полярографировании, мм;

V₁ - объем испытуемого раствора, приготовленного из озоленной навески, см³;

V₂ - объем испытуемого раствора после внесения добавки, см³;

М - масса навески БАД, взятая для озоления, г;

V - объем БАД, взятый для озоления, см³;

Х_к - масса свинца в контрольном растворе, мкг.

Вычисление производят до четвертого десятичного знака.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое (X) результатов двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытаний, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR), приведены в табл. 33.

Таблица 33

Относительные допустимые внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения результатов определения

III. Методы определения микроэлементов

1. Определение йода титрометрическим методом

Принцип метода

Метод основан на взаимодействии йодата калия с йодидом калия в кислой среде (1) и титровании выделившегося йода тиосульфатом натрия (2).

(1) IO_3- + 5I_- + 6Н + (3I₂ + 3Н₂О (из соли) (из KI) (из H₂SO₄)

(2) 2Nа₂S₂О₃ + I₂ (2NaI + Na₂S₄O₆ (тиосульфат (иодат (тетратионат натрия) натрия) натрия)

Специфические аппаратура, материалы и реактивы

1 Калий йодистый (KI) по ГОСТ 4232-74.

2 Кислота серная (H₂SO₄) по ГОСТ 4204-77.

3 Натрий серноватистокислый пятиводный (тиосульфат натрия, Nа₂S₂О₃(5Н₂О) по ГОСТ 27068-86 или фиксанал 0,1 г-экв.

4 Крахмал растворимый по ГОСТ 10163-76.

5 Натрия хлорид, ЧДА, ГОСТ 4233-77.

Приготовление реактивов

0,005 М тиосульфат натрия (Na₂S₂O₃(5H₂O). 1,24 г Na₂S₂O₃(5H₂O) развести в 1000 см³ дистилированной свежепрокипяченной воды. Т.к. кристаллический тиосульфат при хранении набирает влагу, что требует введения поправки на его титр, то в случае возникновения сомнений рекомендуется использовать фиксанал Na₂S₂O₃(5H₂O) 0,1 г-эквивалент, который растворяют в дистиллированной воде, доводя конечный объем до 1000 см³ и полученный раствор разводят в 20 раз (50 см³ раствора + 950 см³ воды) до конечной концентрации 0,005 М.

Полученный раствор хранят в прохладном темном месте. Его объем достаточен для анализа 100 - 200 проб в зависимости от содержания в них йода. При соблюдении условий хранения раствор стабилен не менее одного месяца.

2 Н серная кислота (H₂SO₄). 6 см³ концентрированной H₂SO₄ медленно доливают в 90 см³ воды, затем доводят раствор водой до конечного объема 100 см³. Полученное количество достаточно для анализа 100 проб. Раствор сохраняет свои свойства неопределенно долгое время.

Примечание. Во всех случаях кислоту надо наливать в воду, а не наоборот, во избежание чрезмерного повышения температуры смеси и разбрызгивания кислоты. Во время добавления кислоты раствор следует непрерывно перемешивать.

10 %-ный йодид калия (KI) свежеприготовленный. 10 г KI растворяют в 100 см³ воды. Хранят в прохладном темном месте. Его количества достаточно для анализа 20 проб.

Насыщенный раствор хлорида натрия (NaCl). В колбу объемом 250 см³ с 80 см³ воды постепенно добавляют при перемешивании и/или нагревании NaCl до тех пор, пока не прекратится его растворение. Хранят под пробкой. Раствор сохраняет свои свойства по крайней мере в течение года.

Индикаторный раствор крахмала. В колбу объемом 250 см³ вносят 1 г растворимого крахмала, добавляют 10 см³ воды и нагревают до растворения крахмала. В полученную горячую смесь добавляют 90 см³ насыщенного раствора NaCl и перемешивают. Полученного объема достаточно для анализа 50 проб. Готовый раствор хранят в прохладном темном месте. Раствор остается стабильным на протяжении месяца.

Примечание. В день проведения анализа раствор необходимо прогреть (но не кипятить) для ресуспендирования возможного осадка.

Проведение анализа

Этап 1. Навеску исследуемой пробы массой 10 г растворяют в 100 см³ дистиллированной воды в конической колбе объемом 250 см³. Если полученный раствор мутный, его необходимо профильтровать.

Этап 2. К полученному раствору добавляют 1 см³ 2 н. H₂SO₄, перемешивают, добавляют 5 см³ 10 %-ного раствора KI, перемешивают, закрывают колбу пробкой и помещают на 10 мин. в темное место.

Этап 3. К исследуемому раствору, приобретшему темно-желтую окраску, добавляют из бюретки при перемешивании 0,005 М Na₂S₂O₃ до перехода окраски в светло-желтую. Добавляют в исследуемый раствор примерно 2 см³ индикаторного раствора крахмала, от чего смесь должна приобрести темно-синюю окраску, и продолжают титрование до тех пор, пока последняя не исчезнет.

Отмечают объем раствора тиосульфата, пошедший на титрование.

Требования к безопасности:

·       до начала титрования реакционную смесь следует хранить в темном месте ввиду возможности побочного процесса под воздействием света, который вызывает окисление ионов йодида до йода;

·       при использовании не вполне остывшего раствора крахмала точность определений понижается;

·       если индикаторный раствор добавлен слишком рано, происходит образование прочного, очень медленно реагирующего комплекса йода с крахмалом, что приводит к завышению результатов анализа;

·       реакция должна проходить при умеренной комнатной температуре (ниже 30 °С), поскольку йод характеризуется повышенной летучестью, а индикаторный раствор при нагревании теряет чувствительность.

Обработка результатов

Количество йода, мг/кг исследуемой соли вычисляют по формуле:

, где

V - объем 0,005 М Na₂S₂O₃, пошедший на титрование, см³;

10 - навеска соли, взятой на анализ, г;

100 - пересчет на 100 г соли;

0,1057 - количество йода из йодата калия исследуемого образца соли, соответствующее 1 см³ пошедшего на титрование этого образца 0,005 М Na₂S₂O₃.

Примечание. Из уравнений реакций (1) и (2), лежащих в основе данного метода определения йода в соли, обогащенной КIO₃, следует, что из общего количества йода, оттитровываемого тиосульфатом натрия в исследуемой пробе, на долю йода, происходящего из КIO₃, приходится 1/6 часть, т.е. не 0,6345, а 0,1057 мг.

2. Определение селена спектрофлуориметрическим методом

Принцип метода

Метод основан на флуориметрическом определении комплекса селенистой кислоты с 2,3-диаминонафталином-пиазоселенола, получаемого при мокром сжигании образца смесью азотной и хлорной кислот, с последующим восстановлением соляной кислотой шестивалентного селена до четырехвалентного и образованием комплекса с 2,3-диаминонафталином.

Подготовка к испытанию

Рабочие растворы

0,1 М раствор соляной кислоты: 1 см³ 36 % HCL разбавляют до 100 см³ водой.

0,6 М раствор соляной кислоты: 51 см³ 36 % HCL разбавляют до 100 см³ водой.

Раствор аммиака: 25 % раствор аммиака разбавляют водой 1:1.

Раствор тетранатриевой соли этилендиамин тетрауксусной кислоты (ЭДТА): 1,25 г ЭДТА растворяют в 100 см³ воды.

Раствор 2,3-диаминонафталина (ДАН) - готовят в день определения: 0,1 г ДАН растворяют в 100 см³ 0,1 М соляной кислоты при слабом нагревании. Раствор трижды экстрагируют гексаном, фильтруют через складчатый фильтр и хранят под слоем гексана в темноте при температуре 0 - 4 °С до момента флуориметрического определения. Не допускается облучение прямым светом и использование смазки для шлифов.

Основной стандартный раствор, содержащий 1 мкМ селена/см³:

0,01729 г Nа₂SеО₃ растворяют в небольшом количестве 0,1 М соляной кислоты в мерной колбе на 100 см³, доводят объем до метки соляной кислотой этой же концентрации. Раствор хранят в темноте не более 1 месяца.

Рабочий стандартный раствор, содержащий 1 нМ селена/см³: пипеткой вносят 5 см³ основного стандартного раствора в мерную колбу на 500 см³ и доводят объем до метки 0,1 М соляной кислотой. Раствор хранят в темноте не более 1 месяца.

Мокрое сжигание. Взвешивают и переносят в пробирки для сжигания от 50 до 100 мг БАД и соответствующий образец сравнения. Для построения калибровочного графика в 7 пробирок вносят: 0 (контроль), 0,1; 0,2; 0,4; 0,5; 0,6 мл стандартного рабочего раствора, что соответствует 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,5; 0,6 нМ селена в пробе. Во все пробирки добавляют 1,5 мл смеси, содержащей азотную и хлорную (42 %-ные) кислоты в соотношении 1:0,7 и оставляют при комнатной температуре на 12 - 18 час., затем пробирки помещают в блок для сжигания и минерализуют при 120 °С - 1 час., 150 °С - 1 час., 180 - 185 °С - 1,5 часа. При наличии обугливания сжигание повторяют с новой навеской, увеличив количество хлорной кислоты до 1,0 - 1,4 см³.

Удаление следов азотной кислоты

Блок сжигания охлаждают до 150 °С, добавляют к пробам 1 - 2 капли перекиси водорода и выдерживают при указанной температуре в течение 10 мин. Затем пробы сразу же вынимают из блока сжигания.

Восстановление селената

К пробам добавляют по 1 см³ 6 М соляной кислоты и выдерживают при 110 °С в течение 10 мин. Затем сразу же вынимают из блока сжигания и добавляют 1 см³ дистиллированной воды.

Конденсация селенистой кислоты с ДАН

В каждую пробирку добавляют по 0,5 см³ раствора ЭДТА и по 1 см³ раствора аммиака, быстро доводят рН до 1 - 2 по универсальному индикатору, добавляя при необходимости по каплям раствор аммиака или 0,1 М соляную кислоту. К полученным растворам приливают по 1 см³ раствора ДАН и выдерживают 30 мин при 50 - 55 °С, закрыв предварительно пробирки от прямого света. По окончании реакции пробы охлаждают до комн. температуры и каждую интенсивно встряхивают с 2,5 см³ гексана в течение 50 - 60 сек.

Спектрофлуориметрический анализ

Определение интенсивности флуоресценции осуществляют при длине волны возбуждающего света 376 нм и эмиссионного света 519 нм. Дополнительный контроль за полнотой сжигания осуществляют по спектрам флуоресценции в диапазоне 450 - 600 нм. Полученный спектр должен иметь один максимум 519 нм.

Обработка результатов

Содержание селена, мкг/кг или мкг/л (X) вычисляют по формуле:

Х = 79 ´ С/а, где

С - количество селена, нМ, в пробе, определенное по калибровочному графику;

79 - атомная масса селена;

а - навеска образца, г или см³.

За окончательный результат принимается среднее арифметическое двух параллельных определений.

Метрологические характеристики

Относительное стандартное отклонение в интервале 1 - 600 мкг/кг - не более 10 %.

3. Определение токсичных элементов

Анализируют согласно методов главы 2, раздела II и согласно нормативным документам «Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения содержания токсичных элементов», межгосударственный стандарт ГОСТ 26929-94, ГОСТ 26927-86 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов», межгосударственный стандарт ГОСТ 30178-96 «Методические указания по обнаружению и определению общей ртути в пищевых продуктах методом беспламенной атомной абсорбции № 5178-90», ГОСТ 26930-86 «Сырье и продукты пищевые. Метод определения мышьяка».

Глава 3

МИНОРНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ БАД
(методы определения подлинности БАД)

1. Определение антоцианинов

Антоцианины являются водо-растворимыми пигментами, обусловливающими красную, синюю и фиолетовую окраску фруктов. Они относятся к классу флавоноидов и представляют собой гликозиды катиона флавония (рис. 1).

Рис. 1.

1.1. Методика определения качественного и количественного состава антоцианиновых пигментов с помощью ВЭЖХ

Образцы БАД с антоцианин-содержащими компонентами (экстракты черники, красного винограда и т.д.) экстрагируют дистиллированной водой; образцы соковых концентратов или сиропов разбавляют дистиллированной водой таким образом, чтобы суммарная концентрация антоцианинов составляла 0,05 - 0,2 мг в см³. Пробы фильтруют через мембранный фильтр Zetapor с диаметром пор 0,2 мкм. Разделение проводят на хроматографической колонке PLRP-S (полистирол-дивинилбензол), PolymerLabs, Великобритания), 100 А, 5 мкм, 250´4,6 ID мм, элюент: 4 об. % ортофосфорная кислота, ацетонитрил, 90:10 об. %, скорость подачи элюента 1,0 см³/мин. Детектирование фотометрическое, l = 520 нм.

Идентификацию пиков проводят путем сравнения с хроматограммами ягод с известным составом антоцианиновых пигментов и с литературными данными. Относительное содержание индивидуальных пигментов определяют как отношение площади хроматографического пика и суммы площадей пиков всех идентифицированных антоцианинов. Факторы удерживания антоцианинов приведены в табл. 34.

Таблица 34

Факторы удерживания антоцианиновых пигментов

На рис. 2 приведена хроматограмма антоцианинов сока черники, для которой характерен самый богатый профиль пигментов.

Систематизированные литературные и экспериментальные данные по составу антоцианиновых пигментов окрашенных соков представлены в табл. 35, являются основой при оценке подлинности и качества соков, сокосодержащей продукции и БАД.

1.2. Суммарное содержание антоцианиновых пигментов

Суммарное содержание антоцианиновых пигментов определяли методом рН-дифференциальной спектрофотометрии. Известно, что поглощение антоцианиновых пигментов сильно зависит от рН раствора: в сильнокислой среде окраска большинства антоцианинов ярко-красная, при увеличении рН она постепенно переходит в темно-синюю. Это связано с изменением структуры входящего в состав пигмента агликона. Различие в адсорбции при l = 510 нм и рН 1 и 4,5 пропорционально содержанию антоцианина. Так как различие в величинах молярной адсорбции индивидуальных антоцианинов незначительно, суммарную концентрацию пигментов можно определять относительно одного из них, например, цианидин-3-глюкозида (e = 26900):

,

, где

А - поглощение,

e и MW - коэффициент молярного поглощения и молекулярная масса антоцианина, используемого в качестве стандарта (для цианидин-3-глюкозида 26900 и 449,2 соответственно),

AF - разведение,

AV - объем, мл,

Al - длина кюветы, см,

т - масса образца, мг.

Метрологическая характеристика метода

Предел обнаружения метода 0,001 %. Стандартное отклонение сходимости (Sr) не превышает 0,1 - 0,15. Среднее значение открываемости - 92 - 95 %.

Рис. 2. Хроматограмма антоцианинов черничного сока. Номера пиков соответствуют номерам антоцианинов в табл. 34.

Систематизированные литературные и экспериментальные данные по составу антоцианиновых пигментов окрашенных соков представлены в табл. 35, являются основой при оценке подлинности и качества соков, сокосодержащей продукции и БАД.

Таблица 35

2. Определение органических кислот с помощью ВЭЖХ

Принцип метода

Органические кислоты определяют в условиях обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Разделение органических кислот происходит в хроматографической колонке, наполненной октадецилсиликагелем. Концентрации определяют с помощью спектрофотометрического детектора при l = 210 нм по методу внешнего стандарта.

Приборы и реагенты

Хроматографическая система: насос высокого давления Altex 110А (США), инжектор Rheodyne 7125 (США), колонка Kromasil С18, 5 мкм, 250´4,6 ID мм (MetaChem, США), спектрофотометрический детектор Spectroflow 757 (Kratos, США), система для обработки хроматографических данных МультиХром 1,5х (Амперсенд, Россия).

Подвижная фаза: 0,2 М фосфатный буфер, рН 2,6. Объемная скорость: 1,0 см³/мин. Перед использованием, подвижную фазу фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0,45 mм) или бумажный фильтр («синяя лента»).

Реагенты: калия дигидрофосфат (КH₂РО₄), фосфорная кислота (Н₃РO₄, 85 %), ацетонитрил (CH₃CN), дистиллированная вода.

Приготовление проб и стандартов

Стандартные растворы кислот готовят путем растворения точных навесок соответствующих кислот (purum, ³ 99 %, Fluka или Sigma) в мерных колбах. Градуировочные графики строят в координатах S (площадь пика) - С (концентрация кислоты), г/дм³ в интервале концентраций 0,1 - 30 г/дм³ для яблочной кислоты, 0,1 - 40 г/дм³ для лимонной кислоты, 0,1 - 1 г/ дм³ для аскорбиновой кислоты, 0,05 - 0,5 г/дм³ для изолимонной кислоты, 0,01 - 0,1 г/дм³ для фумаровой кислоты. Растворы фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0,45 мкм) или бумажный фильтр («синяя лента»).

Пробы готовят растворением сухих или разбавлением жидких концентратов БАД в 10 - 25 раз дистиллированной водой. Приготовленные растворы фильтруют через нейлоновый фильтр (диаметр пор 0,45 мкм) или бумажный фильтр («синяя лента»).

ВЭЖХ определение органических кислот

Перед проведением анализа хроматографическую колонку кондиционируют подвижной фазой ацетонитрил: вода (70:30 об. %), затем систему промывают фосфатным буфером до установления ровной базовой линии. Стандартные растворы (5 - 20 мкл) вводят в хроматограф попеременно через каждые 2 - 3 пробы (10 мкл). Порядок элюирования органических кислот в условиях ОФ ВЭЖХ следующий:

Винная < хинная < янтарная < гидроксилимонная < яблочная < изолимонная < шикимовая < аскорбиновая < фумаровая < лимонная

Коэффициенты емкости основных органических кислот, определяемых в БАД на основе фруктов и ягод, представлены в табл. 36.

Таблица 36

Концентрации органических кислот в пробах рассчитываю по площадям или высотам хроматографических пиков.

Примеры хроматограмм органических кислот апельсина и клюквы приведены на рис. 3 и 4.

Рис. 3. Органические кислоты апельсина.

Рис. 4. Органические кислоты клюквы.

3. Определение 5-оксиметилфурфурола в БАД на основе меда и углеводных сиропов

Принцип метода

Метод определения массовой концентрации 5-оксиметилфурфурола в соках, напитках и меде основан на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Метод включает следующие этапы:

·       разбавление аликвоты или навески жидкого БАД дистиллированной водой; растворение навески меда или медосодержащего БАД в дистиллированной воде;

·       фильтрование полученного раствора;

·       обнаружение и количественное определение ОМФ с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором с использованием метода внешнего стандарта.

Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 см³/мин., оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных Мультихром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18) с размером частиц 5 мкм; длина колонки - 25 см, предколонки - 4,5 см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см;

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Спектрофотометр СФ-26, сф-46 или подобный, позволяющий проводить измерения при длинах волн 200 - 350 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1 %.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью ±0,0001 г.

Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания до 200 г, с пределом допустимой погрешности ±0,0005 г по ГОСТ 2404-80.

Дистиллятор.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Термометр жидкостный стеклянный с пределами измерения 0 - 100 °С и ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Фильтры обеззольные ФО-ФС-15 «Синяя лента» по ТУ 2642-001-42624157-98;

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

Калий железистосинеродистый 3-водный по ГОСТ 4207, х.ч., раствор концентрацией 150 г/дм³ (раствор Карреза 1);

Цинк уксуснокислый 2-водный по ГОСТ 5823, ч.д.а., раствор концентрацией 300 г/дм³ (раствор Карреза II);

Фильтр нейлоновый имп. на шприце в обойме 25 мм, размер пор 0,45 мкм;

Бензол для хроматографии, х.ч. по ТУ 6-09-779-76;

Метанол - яд для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-2192-85;

Кислота уксусная > 99,8 %, ос.ч., ГОСТ 18270-72;

Баллон с сжатым азотом, ос.ч. по ГОСТ 9293-74;

5-оксиметилфурфурол (ОМФ) кристаллический, перекристаллизованный из метанола при температуре 64 - 65 °С и атмосферном давлении.

Подготовка к проведению измерений

Приготовление стандартного раствора 5-оксиметилфурфурола

Приготовление основного стандартного раствора 5-ОМФ

0,05 г кристаллического 5-оксиметилфурфурола количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³, растворяют в 25 см³ ацетонитрила, доводят бензолом до метки и тщательно перемешивают. Получают стандартный раствор в смеси бензол-ацетонитрил (9:1) с массовой долей 5-оксиметилфурфурола 0,2 мкг/см³.

Приготовление рабочего стандартного раствора 5-ОМФ

Аликвоту в 1 см³ основного стандартного раствора ОМФ переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, растворитель отдувают досуха в токе азота, доводям метанолом до метки и тщательно перемешивают. Получают рабочий стандартный раствор ОМФ концентрацией 0,002 мкг/см³, который используют при градуировке хроматографа.

Основной и рабочий стандартные растворы 5-оксиметилфурфурола хранят в стеклянной посуде (пикнометре, мерной колбе) с притертой пробкой в прохладном месте (при температуре около 0 °С). Сроки годности основного раствора 1 год, рабочего - 1 неделя.

Установление массовой доли 5-оксиметилфурфурола в рабочем стандартном растворе

Установление точной массовой доли 5-оксиметилфурфурола в рабочем стандартном растворе производят с помощью УФ-спектрофотометрии согласно данным о коэффициенте молярной экстинкции 5-оксиметилфурфурола в максимуме поглощения в УФ-спектре. Снимают УФ спектр рабочего стандартного раствора в метаноле и измеряют его оптическую плотность. Рассчитывают концентрацию ОМФ в рабочем стандартном растворе по формуле:

, где

С - концентрация исследуемого раствора, мкг/см³ или нг/мкл,

D - оптическая плотность раствора;

М - молекулярная масса 5-оксиметилфурфурола (126);

Е - коэффициент молярной экстинкции для метанольного раствора (16830);

L - толщина слоя раствора в см.

Значение относительной погрешности при определении массовой доли 5-оксиметилфурфурола в растворе с помощью УФ-спектрофотометрии не превышает 5 % для доверительной вероятности 0,95.

Приготовление подвижной фазы

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ помещают 150 см³ метанола, примерно 500 см³ бидистиллированной воды и 10 см³ уксусной кислоты, перемешивают и выдерживают до комнатной температуры, затем доводят до метки бидистиллированной водой, тщательно перемешивают.

Подготовка образца

10 см³ сокосодержащего БАД или концентрата фруктового сока помещают в мерные колбы вместимостью 100 см³ или 250 см³, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Полученные растворы фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента» или нейлоновый фильтр.

5 - 10 г меда, медосодержащего пищевого продукта или БАД помещают в мерные колбы вместимостью 100 см³ или 250 см³, добавляют около 50 см³ дистиллированной воды, перемешивают до растворения, последовательно добавляют по 5 см³ растворов Карреза I и Карреза II, каждый раз перемешивая смесь, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента» или нейлоновый фильтр. Аликвоту полученных фильтратов вводят в хроматограф.

Выполнение измерений и вычисление результатов анализа

Условия хроматографического анализа

Подвижная фаза метанол-вода-уксусная кислота (15:84:1), скорость потока 1,0 мл/мин., обнаружение по поглощению в УФ-области спектра при длине волны 284 нм, чувствительность устанавливают 0,01 единиц адсорбции на всю шкалу, вводимый объем образца 5 - 15 мкл.

Вычисление результатов анализа

Массовую концентрацию 5-оксиметилфурфурола рассчитывают по формуле:

, где

М - массовая концентрация 5-оксиметилфурфурола, мг/дм³ или мг/кг (ррm),

m - массовая доля внешнего стандарта ОМФ, введенного для калибровки, хроматографа, нг,

Н_обр. - высота пика исследуемого компонента, соответствующая определенной массовой концентрации компонента в исследуемом образце, мм;

Н_ст - средняя высота пика внешнего стандарта ОМФ, введенного для калибровки хроматографа, мм;

 - общий объем анализируемой пробы, мкл;

 - объем аликвоты, введенной в хроматограф, мкл;

Р - навеска или объем пробы, см³ или г.

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком.

Основные характеристики метода

Предел обнаружения метода составляет 1,0 мг/кг.

Диапазон определяемых концентраций от 1,0 до 1000 мг/кг.

При соблюдении всех регламентируемых методикой условий проведения измерений относительная характеристика погрешности (стандартное отклонение сходимости) результата анализа при концентрации ОМФ в жидких БАД 2,0 мг/л не превышает 0,124 (3,43 %) и при концентрации ОМФ в меде и медсодержащих БАД 5,0 мг/кг - 0,072 (5,34 %).

Среднее значение открываемости ОМФ при концентрациях от 2,0 до 25 мг/кг составляет 87 - 95 %.

4. Определение состава моно- и дисахаридов с помощью ВЭЖХ

Принципиальная схема метода

Метод заключается в пробоподготовке путем разбавления дистиллированной водой образцов жидких БАД или экстракции сухих БАД дистиллированной водой до концентрации сахаров примерно 2 - 10 мг/мл, фильтрования полученного раствора, разделении и количественном определении сахаров с помощью ВЖХ.

Приготовление стандартных растворов

Аналитические образцы фруктозы, глюкозы, сорбита и сахарозы сушат до постоянного веса согласно ГОСТ 12570-67 «Сахар-песок и сахар-рафинад. Метод определения содержания влаги».

Рис. 5. Сироп с 5 мл/100 мл С (5 - ОМФ) = 9,2 мг/л

Готовят стандартные растворы фруктозы, глюкозы, сорбита и сахарозы с концентрациями от 3 до 10 мг/см³ в зависимости от чувствительности рефрактометрического детектора. Для этого навески сахаров массой 1±0,001 г или 0,3±0,001 г помещают в мерные колбы вместимостью 100 см³, доводят бидистиллированной или дистиллированной фильтрованной через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC водой до метки и тщательно перемешивают.

Готовят стандартный раствор смеси фруктозы, глюкозы и сахарозы, с массовыми долями каждого компонента 10 мг/см³ или 3 мг/см³. Для этого навески сахаров массой 1±0,001 г или 0,3±0,001 г помещают в одну мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят бидистиллированной или дистиллированной фильтрованной через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC водой до метки и тщательно перемешивают.

Приготовление исследуемого образца

Анализируемый образец БАД растирают в ступке. Навеску массой 5±0,01 г помещают в мерную колбу вместимостью 250 см³, добавляют 150 см³ подогретой до 75 - 80 °С дистиллированной воды и встряхивают на аппарате для встряхивания 20 - 30 мин. Добавляют 15 см³ 30 %-ного раствора ацетата цинка, встряхивают, охлаждают до комнатной температуры, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC или складчатый бумажный фильтр «синяя лента». Аликвоту фильтрата вводят в хроматограф.

20 см³ сокосодержащего БАД или 10 г углеводсодержащего сиропа помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят бидистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC или через складчатый бумажный фильтр обеззоленный марки ФОМ. Аликвоту фильтрата вводят в хроматограф.

Анализ с помощью ВЭЖХ

Анализ ВЭЖХ с использованием амино фазы

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза ацетонитрил-вода (77:23), скорость подвижной фазы 1,0 - 1,5 мл/мин., аликвота, вводимая в инжектор 10 - 15 мкл; чувствительность рефрактометрического детектора устанавливают таким образом, чтобы ввод 100 мкг фруктозы, глюкозы или сахарозы соответствовал отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 1 до 3 % от полной шкалы; входное напряжение регистрирующего потенциометра (самописца) или интегратора 10 mV.

Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах при использовании амино-фазы: фруктоза - 6±2, сорбит 6,5±2, глюкоза 7,5±1, сахароза 10±1.

Анализ ВЭЖХ с использованием колонки и предколонки с катионитом в форме Са⁺⁺.

Условия ВЭЖХ: катионообменная колонка и предколонка «Rezex RCU-USP Sugar Alcohols» в форме Са⁺⁺, температура колонки 80 - 90 °С, подвижная фаза бидистиллированная, деионизированная и фильтрованная вода, скорость подвижной фазы 0,4 - 0,8 мл/мин., аликвота, вводимая в инжектор 10 - 15 мкл; чувствительность хроматографа устанавливается таким образом, чтобы 30 мкг фруктозы, глюкозы и сорбита соответствовало отклонению пера на полную шкалу самописца при уровне шума от 1 до 3 % от полной шкалы; входное напряжение регистрирующего потенциометра (самописца) или интегратора 10 mV.

Ориентировочный порядок времен удерживания углеводов в минутах при использовании колонки и предколонки с катионитом в форме Са⁺⁺: сахароза 10±1, глюкоза 12±0,5, фруктоза - 14,5±0,2, сорбит 22±0,5.

Предел обнаружения метода 0,02 - 0,05 %. Стандартное отклонение сходимости (Sr) при концентрации сахаров 10 % не превышает 0,05 - 0,07. Среднее значение открываемости от внесенного количества сахаров - 97 - 99 %.

Перед работой хроматограф калибруют, для чего в инжектор с помощью микрошприца вводят 0,002, 0,005 и 0,01 см³ стандартной смеси углеводов, что соответствует количествам 20, 50 и 100 мкг фруктозы, глюкозы и сахарозы (детектор RIDK 102) или 6, 15 и 30 мкг (детектор MERK L 7490). Для каждого количества углеводов определяют площадь пика на хроматограмме. Аналогичным образом проводят калибровку стандартного раствора сорбита.

Количественное определение углеводов

Идентификацию и количественное определение углеводов осуществляют методом внешних стандартов.

В инжектор хроматографа вводят 0,01 см³ (10 мкл) фильтрата. Определяют площадь пика углевода, соответствующего по времени удерживания одному из стандартов. Расчет концентрации фруктозы, глюкозы, сорбита и сахарозы проводят по формуле:

, %, где

С - концентрация углевода в образце, %,

V₁ - объем, до которого доведена навеска при разбавлении водой, см³ (100 см³),

V₂ - объем фильтрата, внесенный в хроматограф, 0,01 см³,

m - масса стандарта, введенного в хроматограф, мкг,

М - навеска образца, взятая для анализа, г.

Если пик углевода в образце выходит за пределы шкалы самописца, анализ проводят повторно после разбавления фильтрата водой, т.е. после увеличения объема V₁.

Рис. 6. Хроматограмма БАД на основе вишневого сока.

5. Определение массовой концентрации кофеина, теобромина, теофиллина

Принцип метода

Метод определения массовой концентрации кофеина, теобромина, теофиллина в пищевых продуктах, БАД и безалкогольных напитках основан на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Метод анализа кофеина и теофиллина в БАДах включает следующие этапы:

·          экстракцию пуриновых алкалоидов из БАД в дистиллированной воде при нагревании;

·          фильтрование полученного раствора;

·          обнаружение и количественное определение с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором с использованием метода внешнего стандарта.

Метод анализа теобромина, теофиллина и кофеина в пищевых продуктах и БАД на основе какао включает следующие этапы:

·          экстакцию в дистиллированной воде, рН 7,3 - 7,8 при нагревании;

·          переэкстракцию в хлороформ;

·          переэкстракцию в фосфатный буфер, рН 3,0

·          фильтрование полученного раствора;

·          обнаружение и количественное определение пуриновых алкалоидов с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором с использованием метода внешнего стандарта.

Средства измерений, материалы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 см³/мин., оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных Мультихром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18) с размером частиц 5 мкм; длина колонки - 25 см, предколонки - 4,5 см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см;

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью ±0,0001 г.

Дистиллятор

рН-метр, модель «рН 150М».

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Термометр жидкостный стеклянный с пределами измерения 0 - 100 °С и ценой деления 1 °С по ГОСТ 28498.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Бумага фильтровальная «красная лента» и «синяя лента» по ТУ 6-09-1678-95.

Баллон с сжатым азотом марки ПНГ;

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч., ГОСТ 6552, раствор массовой концентрацией 2,72 г/дм³, доведенный до рН 3,2 добавлением 2 - 2,5 см³ ортофосфорной кислоты.

Кислота уксусная, ГОСТ 61-75, ч.д.а.

Кислота о-фосфорная, ч, ГОСТ 6552.

Кофеин, теобромин, теофиллин по действующей нормативно-технической документации.

Натрий гидроокись, х.ч., ГОСТ 4228, раствор массовой концентрации 0,4 г/дм³.

Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233.

Подготовка к проведению измерений

Приготовление рабочих растворов кофеина, теобромина теофиллина (400 мг/см³)

Навески массой по 100,0±0,1 мг помещают в мерные колбы вместимостью 250 см³, до половины заполненные дистиллированной водой. Перемешивают до полного растворения, затем доводят дистиллятом до метки и перемешивают.

Приготовление стандартных растворов кофеина, теобромина, теофиллина (0,004 мг/см³).

Отмеряют пипеткой по 2,0 см³ каждого рабочего раствора кофеина, теобромина, теофиллина концентрациями 400 мг/см³, переносят в мерные колбы вместимостью 250 см³, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Приготовление подвижной фазы

Приготовление подвижной фазы для анализа кофеина

50 см³ ацетонитрила помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, добавляют 10 см³ уксусной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу «красная лента».

Приготовление подвижной фазы для анализа смеси алкалоидов

2,72 г калия фосфорнокислого однозамещенного помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, растворяют в дистиллированной воде, перемешивают до полного растворения, доводят дистиллированной водой до метки. Полученный раствор ортофосфорной кислотой доводят до рН 3,2 (2 - 2,5 см³). 850 см³ полученного буферного раствора смешивают с 150 см³ ацетонитрила и полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу «красная лента».

Подготовка образцов

Образцы тонизирующих напитков («Кола», тоники) подвергают по необходимости дегазации по ГОСТ 6687.2 при температуре не более 25 °С и отфильтровывают через бумажный фильтр. Аликвоту напитков (2 - 5 см³) помещают в мерную колбу вместимостью 250 см³, доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.

Навеску пищевого продукта (2 - 5 ±0,01 г) (например, чай, кофе), БАД на основе натуральных растительных компонентов гуараны, орехов колы, листьев матэ и др. (5 - 10 капсул или таблеток, растертых в ступке) помещают в мерную колбу вместимостью 250 см³, добавляют до половины объема подогретой до 70 - 80 °С дистиллированной воды, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 15 - 20 мин, охлаждают до комнатной температуры, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Фильтруют через бумажный фильтр с размером пор 0,5 мкм.

Навеску кондитерского изделия (10 - 20 ±0,01 г), содержащего какао-порошок (карамели, шоколад, ореховые пасты, глазурь и др.), измельченную на терке или в ступке, помещают в коническую колбу вместимостью 250 см³ и добавляют 100 см³ дистиллированной воды, подщелоченной 5 - 10 каплями раствора гидроокиси натрия (рН 7,5 - 8,0). Смесь подогревают до температуры 45 - 50 °С, перемешивают на аппарате для встряхивания 20 - 30 мин, фильтруют через бумажный фильтр «красная лента» и отбирают 80 см³ фильтрата. Если фильтрация затруднена, смесь центрифугируют при 2000 об/мин и также отбирают 80 см³. К фильтрату добавляют 1,5 - 2 г хлористого натрия, перемешивают до растворения соли и переносят в делительную воронку. Пуриновые алкалоиды из водного раствора экстрагируют 50 см³ хлороформа. Хлороформный раствор отделяют и встряхивают с 50 см³ раствора калия фосфорнокислого однозамещенного, рН 3,2, после чего водный экстракт фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента». Остатки хлороформа из фильтрата удаляют в токе азота. Аликвоту полученного экстракта вводят в хроматограф. При анализе используют метод внешнего стандарта.

Проведение анализа ВЭЖХ и расчет концентрации пуриновых оснований

Условия ВЭЖХ для хроматографического анализа кофеина: подвижная фаза ацетонитрил - вода дистиллированная - уксусная кислота (15:84:1). Скорость потока 0,7 см³/мин. Обнаружение по поглощению в УФ-области спектра при длине волны 272 нм, шкала чувствительности 0,01 Е. О. П. Вводимый объем образца 10,0 мм³.

Условия ВЭЖХ для хроматографического анализа смеси алкалоидов: подвижная фаза: раствор калия фосфорнокислого однозамещенного, рН 3,2-ацетонитрил (85 - 15), скорость потока 0,8 см³/мин, УФ-детектирование, длина волны 272 нм, шкала чувствительности 0,01 Е. О. П. Вводимый объем образца 10,0 мм³.

Примерные времена удерживания пуриновых алкалоидов: теобромин 4,9±0,1, теофиллин 7,7±0,1, кофеин 12,0±0,1.

Расчет концентраций пуриновых оснований

Массовую концентрацию теобромина, теофиллина или кофеина рассчитывают по формуле:

, мг/кг, где

S_обp. - площадь пика исследуемого компонента;

S_ст. - - площадь пика соответствующего стандарта;

V₁ - объем анализируемого раствора пробы, мм³;

V₂ - объем экстракта, введенного в хроматограф, мм³;

m_cm. - масса стандарта пуринового алкалоида, введенная в хроматограф, нг;

М_обр. - навеска образца, взятая для анализа и соответствующая объему фильтрата после экстракции подщелоченной водой, г, (8 г).

Вычисления проводят до второго десятичного знака. За результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком.

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений при доверительной вероятности Р = 0,95 не должно превышать 13 %.

Характеристика погрешности измерений

При соблюдении всех регламентируемых методикой условий проведения измерений относительная характеристика погрешности (стандартное отклонение сходимости) результата анализа при концентрации кофеина в БАД 2,0 мг/таблетку или капсулу не превышает 0,154 (3,43 %), при концентрации теобромина в пищевом продукте 5 мг/100 г - 0,066 (4,89 %).

Предел обнаружения метода определения пуриновых алкалоидов (теобромина, теофиллина, кофеина) в пищевых продуктах составляет 1,0 - 2,0 мг/кг. Диапазон определяемых концентраций от 1,0 до 1000 мг/кг.

Среднее значение открываемости пуриновых алкалоидов в БАД при концентрациях от 2,0 до 20 мг/таблетку составляет 87 - 95 %, в пищевых продуктах при концентрациях от 5,0 до 25 мг/100 г - 82 - 90 %.

6. Определение массовой концентрации хинина

Приготовление стандартных растворов

Приготовление градуировочного раствора хинина (800 мг/см³)

Навеску хинина массой 200,0 мг помещают в мерную колбу вместимостью 250 см³, до половины заполненную бидистиллированной водой. Перемешивают до полного растворения, затем доводят бидистиллятом до метки и перемешивают.

Приготовление градуировочного раствора хинина (0,008 мг/см³).

Отмеряют пипеткой 2,0 см³ градуировочного раствора хинина концентрации 800 мг/см³, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят до метки бидистиллированной водой и перемешивают.

Приготовление подвижной фазы

2,72 г калия фосфорнокислого однозамещенного (KH₂PO₄) помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, растворяют в бидистиллированной воде, перемешивают до полного растворения. Полученный раствор ортофосфорной кислотой (Н₃РO₄) доводят до рН 3,0 и фильтруют через фильтровальную бумагу с диаметром пор 0,5 мкм. 760 см³ полученного буферного раствора смешивают с 240 см³ ацетонитрила (С₂Н₃N). Срок годности полученного раствора не более недели.

Подготовка образца

Образцы напитков подвергают дегазации по ГОСТ 6687.2 при температуре не более 25 °С и отфильтровывают через бумажный фильтр.

Проведение анализа

Условия хроматографического анализа

Подвижная фаза 24 % ацетонитрила, 76 % 0,02 М раствора KH₂PO₄, доведенного ортофосфорной кислотой до рН 3,0. Скорость потока 2,0 мл/мин. УФ-детектирование, длина волны 254 нм.

Массовую концентрацию хинина рассчитывают сравнением площадей пиков образца и стандарта хинина по аналогии с формулой в разделе 5.

7. Определение содержания коэнзима Q10

Метод основан на определении высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Оборудование и реактивы

Жидкостной хроматограф с УФ-детектором.

Стандартный раствор Коэнзим Q10 концентрацией 100 мкг/мл готовят в смеси этанол-эфир (1:1).

Подготовка проб

Коэнзим Q10 - убихинон, не растворим в воде, но хорошо растворим в спирте и эфире.

Из образца (обычно это капсулы) его выделяют растворением в смеси 96 %-ный этанол-эфир (1:1) Капсулы прокалывают в нескольких местах иглой, заливают смесью растворителей и оставляют при комнатной температуре в темном месте в плотно укупоренной склянке на сутки. Через сутки пробы хроматографируют.

Проведение испытания

Условия ВЭЖХ: Колонка из нержавеющей стали, длина 150 мм, диаметр 4 - 6 мм. Сорбент - Сепарон SGX С18, размер частиц 7 мкм. Перед работой новую колонку промывают 40 мл изопропанола, затем 80 мл деионизированной воды, после чего уравновешивают колонку подвижной фазой до стабильной нулевой линии.

Подвижная фаза: 96 % этанол, очищенный перегонкой. Детектирование: спектрофотометр, длина волны УФ 290 нм, шкала чувствительности 0,05 AUFS. скорость потока 10 мл/мин, время удерживания коэнзима Q - 8,2 мин.

Обработка результатов: стандартный образец и испытываемую пробу хроматографируют не менее трех раз. Расчет содержания Коэнзима Q производят методом абсолютной калибровки. Ошибка метода ±5 %.

8. Определение L-карнитина (g-триметил-р-гидроксибутиробетаин)

L-карнитин - гигроскопические кристаллы, хорошо растворимые в воде, в этаноле. Мало растворим в ацетоне, изопропаноле, не растворим в эфире.

Метод определения массовой концентрации L-карнитина в БАД и пищевых продуктах основан на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Метод анализа включает следующие этапы:

·       экстракцию L-карнитина из БАД и пищевых продуктов подщелоченной дистиллированной водой при нагревании;

·       осаждение высокомолекулярных составляющих экстракта ацетатом цинка;

·       фильтрование полученного раствора;

·       обнаружение и количественное определение с помощью йон-парной ВЭЖХ с УФ детектором и использованием метода внешнего стандарта.

Средства измерений, материалы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 см³/мин., оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных Мультихром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18) с размером частиц 5 мкм; длина колонки - 25 см, предколонки - 4,5 см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см;

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью ±0,0001 г.

Дистиллятор

рН-метр, модель «рН 150М».

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Термометр жидкостный стеклянный с пределами измерения 0 - 100 °С и ценой деления ГС по ГОСТ 28498.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Бумага фильтровальная «красная лента» и «синяя лента» по ТУ 6-09-1678-95.

Баллон со сжатым азотом марки ПНГ;

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.

Кислота о-фосфорная, ч, ГОСТ 6552.

Додецилсульфат, натриевая соль, SERVA, раствор 0,005М в дистиллированной воде.

L-карнитин по действующей нормативно-технической документации.

Натрий гидроокись, х.ч., ГОСТ 4228, раствор массовой концентрации 0,4 г/дм³.

Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233.

Цинк уксуснокислый 2-водный, ч.д.а., ГОСТ 5823-78, раствор 30 %-ный в дистиллированной воде.

Подготовка к проведению измерений

Приготовление рабочего раствора L-карнитина (400 мг/см³)

Навеску L-карнитина массой 100,0±0,1 мг помещают в мерную колбу вместимостью 250 см³, до половины заполненную дистиллированной водой. Перемешивают до полного растворения, затем доводят дистиллятом до метки и перемешивают.

Приготовление стандартного раствора L-карнитина (0,004 мг/см³).

Отмеряют пипеткой 2,0 см³ рабочего раствора L-карнитина концентрацией 400 мг/см³, переносят в мерную колбу вместимостью 200 см³, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Приготовление подвижной фазы

1,44 г додецилсульфата натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см³, растворяют в дистиллированной воде, перемешивают до полного растворения, доводят дистиллированной водой до метки. Полученный раствор ортофосфорной кислотой доводят до рН 2,5 (2,5 - 3,06 см³). 850 см³ полученного буферного раствора смешивают с 350 см³ ацетонитрила и полученный раствор фильтруют через фильтровальную бумагу «красная лента».

Подготовка проб

Выделение L-карнитина осуществляли следующим образом: навеску (2 г) измельченного БАД или продукта помещали в мерную колбу вместимостью 250 см³, добавляли 125 см³ горячей (60 - 65 °С) дистиллированной воды, подщелоченной раствором NaOH массовой концентрации 0,4 г/дм³ (рН 8,0 - 8,5), встряхивали на аппарате для встряхивания 30 минут, охлаждали до комнатной температуры, добавляли 30 см³ 30 %-ного раствора ацетата цинка доводили дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивали и фильтровали через бумажный фильтр «красная лента» или через капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC.

Проведение испытания

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза раствор 0,005 М додецилсульфоната натрия - ацетонитрил (65:35). Скорость потока 1,0 см³/мин. Обнаружение по поглощению в УФ-области спектра при длине волны 210 нм, шкала чувствительности 0,01 Е.О.П. Вводимый объем образца 10,0 мм³. Время удерживания карнитина - 7,5±1,0 мин.

Расчет концентраций L-карнитина

Массовую концентрацию L-карнитина рассчитывают по формуле:

, мг/100 г, где

 - площадь пика исследуемого компонента;

 - площадь пика стандарта;

V₁ - объем анализируемого раствора пробы, мм³;

V₂ - объем экстракта, введенного в хроматограф, мм³;

 - масса стандарта, введенная в хроматограф, нг;

 - навеска образца, взятая для анализа.

Обработка результатов. Характеристика погрешности измерений

За результат принимают среднее арифметическое результатов трех параллельных измерений и выражают целым числом с одним десятичным знаком. Относительное допустимое расхождение между результатами параллельных определений при доверительной вероятности Р = 0,95 не должно превышать 13 %. Ошибка метода ±5 %.

Среднее значение открываемости L-карнитина в БАД при концентрациях 10 - 20 мг/таблетку или в пищевых продуктах при концентрациях от 100 мг % составляет - 85 - 93 %.

9. Определение полифенольных соединений

Принцип метода

Суммарное содержание фенольных соединений определяют модифицированным методом Фолина-Чокальтеу. Полифенольные соединения окисляются реактивом Фолина-Чокальтеу, состоящим из смеси фосфорно-вольфрамовой H₂PW₁₂O₄₀ и фосфорно-молибденовой Н₃РMo₁₂О₄₀ кислот, который, в свою очередь, восстанавливается в смесь окислов вольфрама (W₈O₂₃) голубого цвета и молибдена (Mo₈O₂₃). Абсорбция раствора при 750 нм пропорциональна содержанию фенольных соединений. В качестве полифенольного стандарта используют галловую кислоту.

Приборы и реактивы

Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный, позволяющий проводить измерения при длинах волн 200 - 350 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1 %.

Колориметр фотоэлектрический лабораторный КФК-2 (или аналогичный) ГОСТ 12083.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, ТУ 64-1-2451-78.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с пределом взвешивания 200 г и погрешностью ±0,0001 г.

рН-метр лабораторный ЭВ-74 (или аналогичный) по ТУ 25-05-27-57.

Дистиллятор.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Стакан мерный В-1-500ТС вместимостью 500 см³ по ГОСТ 25336.

Цилиндры 2-1000 и 2-100 по ГОСТ 1770.

Натрия вольфрамат по ГОСТ 18289.

Натрия молибдат по ГОСТ 10931.

Кислота ортофосфорная 85 %-ная по ГОСТ 6552.

Кислота соляная конц. по ГОСТ 3118.

Литий сернокислый (сульфат лития).

Натрий углекислый (карбонат натрия) по ГОСТ 83.

Водорода перекись по ГОСТ 177.

Бром по ГОСТ 4109.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Галловая кислота по действующей нормативно-технической документации.

Подготовка к выполнению измерений

Приготовление реактива Фолина

100 г вольфрамовокислого натрия и 25 г молибденовокислого натрия растворяют в 700 см³ дистиллированной воды. Добавляют 50 см³ 85 %-ной фосфорной кислоты (d = 1,71 г/см³), 100 см³ концентрированной соляной кислоты (d = 1,19 г/см³) и кипятят на водяной бане в колбе с обратным холодильником под тягой в течение 10 ч. Добавляют 150 г сернокислого лития, несколько капель брома и снова кипятят в течение 15 мин. Смесь охлаждают до комнатной температуры, переносят в мерную колбу вместимостью 1 дм³ и доводят объем до метки дистиллированной водой. Хранят реактив в темной бутылке со шлифом в холодильнике.

Приготовление раствора карбоната натрия

В мерную колбу вместимостью 1 дм³ наливают около 500 см³ дистиллированной воды и растворяют 200 г карбоната натрия при встряхивании. Доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Получают раствор карбоната натрия с концентрацией 20 %.

Раствор галловой кислоты

В мерный стакан вместимостью 500 см³ помещают 50 см³ этилового спирта, доводят до метки 400 см³ дистиллированной водой. Погружают в стакан электроды рН-метра и добавляют соляную кислоту до значения рН 3,2 - 3,25. Переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью 500 см³, при встряхивании растворяют 15 мг галловой кислоты и доводят дистиллированной водой до метки. Концентрация галловой кислоты 0,03 мг/см³.

Построение градуировочной кривой

1, 2, 5, 10, 20 см³ раствора галловой кислоты помещают в 5 мерных колб вместимостью 100 см³. В шестую колбу вносят 1 см³ дистиллированной воды - контрольный раствор.

В каждую мерную колбу добавляют по 1 см³ реактива Фолина-Чокальтеу, по 10 см³ раствора карбоната натрия, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Через 20 - 30 мин измеряют оптическую плотность растворов в кювете 10 мм при длине волны 750 нм против контрольного раствора.

По полученным данным строят градуировочную кривую, откладывая по оси абсцисс массовую концентрацию галловой кислоты, а по оси ординат - оптическую плотность.

Выполнение измерений

БАД на растительной и фруктовой основе (таблетки, капсулы) растирают в ступке, навеску 1 - 2 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, заполненную до половины дистиллированной водой, нагретой до 40 °С, и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 45 - 60 мин, периодически подогревая колбу.

Сокосодержащие БАД (растворы, сиропы) разбавляют в 5 - 10 раз дистиллированной водой.

1 см³ полученных растворов помещают в мерные колбы вместимостью 100 см³ и далее выполняют действия как в разделе «Построение градуировочной кривой».

Вычисление результатов определения.

Значение массовой концентрации фенольных веществ (С) в мг/дм³ по галловой кислоте определяют по градуировочной кривой. Полученную величину умножают на коэффициент разведения - 100, если экстракт разбавляли в 5 раз или вычисляют по формуле:

С = А´ОП, где

А - коэффициент разбавления,

ОП - оптическая плотность.

Вычисления проводят до первого десятичного знака и округляют до целого числа. За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.

Характеристика погрешности измерений

Допустимое значение погрешности измерений массовой концентрации фенольных соединений в БАД на растительной основе или сокосодержащих БАД не должно превышать:

для диапазона концентраций в экстракте или растворе 100 - 600 мг/дм³ - ±8 мг/дм³,

для диапазона концентраций в экстракте или растворе 600 - 3000 мг/дм³ - ±33 мг/дм³.

10. Определение флавоноидов

10.1. Введение

Флавоноиды представляют собой большую группу природных полифенольных соединений с двумя ароматическими кольцами, имеющими основную структуру С6-С3-С6. Флавоноиды являются мощными природными антиоксидантами, обладающими широким спектром биологической активности. Особенно богаты флавоноидами высшие растения, относящиеся к семействам розоцветных (различные виды боярышников, черноплодная рябина), бобовых (софора японская, стальник полевой, солодка), гречишных (различные виды горцев - перечный, почечуйный, птичий: гречиха), астровых (бессмертник песчаный, сушеница топяная, пижма), яснотковых (пустырник сердечный) и др.

В основе структуры большинства флавоноидов лежат производные флавана (2-фенил-хроман или 2-фенил-бенз-g-пиран), приведенного на рис. 7, которые, в свою очередь, разделяются на производные хромана и хромона.

Рис. 7.

К производным хромана относятся катехины, лейкоантоцианидины и антоцианидины.

Катехины. Основные структуры катехинов (флаван-3-олов) приведены на рис. 8.

Рис. 8. Структуры основных катехинов (флаван-3-олов):

(I) - (+)-катехин; (II) - R = Н (-)-эпикатехин, R = ОН - (-)-эпигаллокатехин; (III) - R = Н (-)-эпикатехингаллат; R = ОН (-)-эпигаллокатехингаллат.

Лейкоантоцианидины. Как видно из приведенной структуры на рис. 9 лейкоантоцианидины или проантоцианидины (флаван-3,4-диолы) представляют собой 4-гидроксипроизводное катехина.

Рис. 9.

Антоцианидины. Особенность строения антоцианидинов (рис. 10) в том, что кислород в пирановом кольце в кислой среде образует оксониевый катион. Поэтому антоцианидины в кислом растворе ведут себя как катионы и образуют соли с кислотами, а в щелочном растворе - как анионы и образуют соли с основаниями. Антоцианидины являются интенсивно окрашенными природными пигментами, их окраска изменяется в зависимости от рН среды. Оксониевые формы (соли катионов) антоцианидинов окрашены в красный цвет с оттенками: желтоватыми (пеларгонидин), фиолетовым (цианидин), синеватым (дельфинидин). Щелочные соли окрашены в синий цвет.

Антоцианидины являются агликонами большого класса природных красителей -антоцианинов (см. раздел 1).

Рис. 10.

Среди других представителей этой группы следует отметить 2-фенилпроизводные хромана: флаваноны и флаванонолы, структуры которых представлены на рис. 11.

Рис. 11.

(I) - флаванон, (II) - флаванонол.

К флаванонам относятся нарингенин - 5,7,4¢-тригидроксифлаванон, гесперетин - 5,7,3¢-тригидрокси-4¢-метоксифлаванон и эриодиктиол - 5,7,3,4-тетрагидро-ксифлаванон. Наиболее распространенными в экстрактах цитрусовых являются 7-O-гликозил-нарингенин - нарингин и 7-О-гликозилгесперетин - геспередин (см. раздел 11.2).

В БАД на основе экстрактов лиственницы и ряда других растений содержатся производные флаванон-3-олов: дигидрокверцетин - 5,7,3,4-тетрагидроксифлаванон-3-ол и дигидрокемпферол - 5,7,4-тригидроксифлаванон-3-ол (см. раздел 11.3).

Из производных хромона, представленных на рис. 12, наиболее распространены в растениях соединения типа флавона и флавонола, имеющих непредельную связь в положении 2, 3. В отличии от их гидрированных аналогов - флаванонов и флаванонолов - это наиболее устойчивые флавоноиды.

Рис. 12.

(I) - флавон, (II) - флавонол.

Флавоноиды, у которых фенильная группа с С2 смещена к С3, называются изофлавоноидами (рис. 13).

Рис. 13.

(I) - даидзеин, (II) - даидзин, (III) - генистеин, (IV) - генистин, (V) - глицитеин, (VI) - глицитин.

Структуры и наименования основных флавонолов представлены на рис. 14, структуры флавонов - на рис. 15.

10.2. Методы определения флавоноидов

В основе количественного определения флавоноидов лежит спектрофотометрия при длине волны 415 нм продуктов взаимодействия с раствором хлорида алюминия. К флавоноидам относятся производные флавона: флавонолы (рутин - рутинозид кверцетина, гиперозид - галактозид кверцетина, морин, кверцетин, мирицетин, кемпферол, кверцитрин, галангин) и флавоны (хризин, апигенин, лютеолин, изовитексин, изоориентин). Для определения производных флавана: флаванон-3-олов (дигидрокверцетин или таксифолин, дигидрокемферол, силибин), флаванонов (нарингин, ±-нарингенин, гесперетин) используется спектрофотометрия при длине волны 495 нм продуктов их реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.

Рис. 14.

(I) - кверцетин, (II) - изорамнетин, (III) - кемпферол, (IV) - мирицитин, (V) - рутин.

Рис. 15.

Принцип колориметрического метода, основанного на взаимодействии с алюминий хлоридом, заключается в том, что реагент образует кислотоустойчивые комплексы с С-4 кето группой и или с С-3 или С-5 гидроксильной группой флавонов и флавонолов, имеющие максимумы поглощения в диапазоне длин волн 415 - 440 нм.

Принцип взаимодействия с 2,4-динитрофенилгидразином основан на его реакции с кетонами и альдегидами с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов. Следовательно, флавоны, флавонолы и изофлавоны с С₂ - С₃ двойной связью не способны реагировать с 2,4-динитрофенилгидразином, в то время, как гидразоны и флавононы образуют соединения, имеющие максимум поглощения при 495 нм.

Приборы и реактивы

Спектрофотометр СФ-26, СФ-46 или подобный (Shimadzu UV-160A, Япония), позволяющий проводить измерения при длинах волн 190 - 900 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1 %;

Метанол - яд для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-2192-85;

Спирт этиловый ректификованный очищенный дистилляцией.

Алюминия хлористый, 6-водный, х.ч., ГОСТ 3759-75, раствор 10 %-ный в 95 %-ном этаноле;

2,4-динитрофенилгидразин (2,4-Д), раствор: 1 г 2,4-Д растворяют в 2 см³ 96 %-ной серной кислоты и доводят метанолом до объема 100 см³, концентрация полученного раствора 10 мг/см³;

Натрия гидроокись, х.ч.: 1 %-ный раствор в 70 %-ном метаноле;

Натрия ацетат, 1 М раствор.

Приготовление стандартных растворов для калибровки спектрофотометра

10±0,1 мг кверцетина растворяют в 80 %-ном этаноле и затем разбавляют в мерных колбах до концентраций 25, 50 и 100 мкг/см³.

20±0,1 мг ±-нарингенина растворяют в метаноле и затем разбавляют до концентрации 500, 1000 и 2000 мкг/см³.

Подготовка образца

1,0 г измельченного образца кипятят в 30 см³ 90 %-ного этилового спирта, содержащего 0,5 % концентрированной серной кислоты, на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают в мерную колбу вместимостью 100 см³ и экстракцию повторяют еще раз. Объединенную смесь охлаждают, фильтруют и доводят объем до 100 см³ 90 %-ным этанолом (раствор А).

Колориметрический метод с алюминий хлоридом (суммарное определение флавонолов)

По 0,5 см³ каждого разбавленного стандарта кверцетина смешивают с 1,5 см³ 95 %-ного этанола, 0,1 см³ 10 %-ного хлорида алюминия, 0,1 см³ 1 М ацетата натрия и 2,8 см³ дистиллированной воды. Смесь инкубируют при комнатной температуре 30 мин и измеряют оптическую плотность полученного раствора при 415 нм. Для приготовления раствора сравнения используют разбавленный в дистиллированной воде 10 %-ный хлорид алюминия.

Колориметрический метод с 2,4-динитрофенилгидразином (суммарное определение флаванонов)

По 1,0 см³ каждого разбавленного стандартного раствора ±-нарингенина смешивают с 2,0 см³ 1 %-ого раствора 2,4-Д и 2,0 см³ метанола. Смесь выдерживают при 50 °С в течение 50 мин. После охлаждения до комнатной температуры к смеси добавляют 5 см³ 1 %-ного раствора едкого натра в 70 %-ном метаноле и инкубируют при комнатной температуре в течение 2-х минут. Затем к 1 см³ смеси добавляют 5 см³ метанола и центрифугируют при 1000 об/мин, в течение 10 мин. Отделяют супернатант и в мерной колбе доводят до объема 25 см³. Измеряют оптическую плотность раствора при 495 нм против раствора сравнения - метанола.

Проведение испытаний

Отбирают по 0,5 см³ гидролизата (раствор А) и проводят колориметрические реакции с хлоридом алюминия и 2,4-Д как описано выше. Определяют содержание флавоноидов согласно калибровочным графикам.

11. Анализ индикаторных показателей некоторых БАД на растительной основе

11.1. Определение катехинов и галловой кислоты в БАД на основе зеленого чая и в травяных чаях

Катехины - это флаван-3-олы, структура которых представлены на рис. 8.

Приборы и реактивы

Жидкостной хроматограф с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 см³/мин., обеспечивающий работу в режиме градиентного элюирования, оборудованный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны и системой для сбора и обработки хроматографических данных Мультихром, версия 1,5х (Амперсенд, Россия).

Колонка и предколонка хроматографические с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (силикагель С18) с размером частиц 5 мкм; длина колонки - 15 см, предколонки - 4,5 см, внутренний диаметр колонок - 0,46 см;

Микрошприцы МШ-10 и МШ-25 для жидкостной хроматографии.

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-74.

Спирт этиловый ректификованный.

Кислота о-фосфорная, ч, ГОСТ 6552, раствор 0,1 %: 1,2 см³ фосфорной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 1 дм³, добавляют около 950 см дистиллированной воды, перемешивают, охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки и перемешивают.

Метанол - яд для жидкостной хроматографии, ос.ч. по ТУ 6-09-14-2192-85;

Спирт этиловый ректификованный очищенный дистилляцией.

Капроновый фильтр марки 0,45 мкм RC;

Фумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ.

(+)-Катехин, (+)-эпикатехин, (-)-эпигаллокатехин, (-)-эпигаллокатехин галлат, галловая кислота - SIGMA Chemical Co.

Приготовление стандартного раствора

5±0,1 мг (+)-катехина предварительно высушенного при 105 °С в течение 1 ч, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют около 70 см³ 0,1 %-ного раствора фосфорной кислоты, перемешивают до полного растворения вещества, охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки 0,1 %-ным раствором фосфорной кислоты и перемешивают. Концентрация полученного стандартного раствора катехина 0,05 мг/см³. 5 см³ полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, доводят до метки 0,1 %-ным раствором фосфорной кислоты и перемешивают. Концентрация полученного рабочего стандартного раствора катехина 0,005 мг/см³. В хроматограф вводят 10 мкл.

Подготовка образца

1 г порошка экстракта листьев, 2 г измельченных листьев, таблеток или содержимого капсул помещают в химический стакан вместимостью 250 см³, добавляют 50 см³ 0,1 %-ного раствора фосфорной кислоты и проводят экстракцию в ультразвуковой бане в течение 5 мин. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента» в мерную колбу вместимостью 250 см³ или при необходимости центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, а затем супернатант помещают в мерную колбу на 250 см³, доводят до метки 0,1 %-ным раствором фосфорной кислоты и перемешивают (раствор А). Раствор анализируют с помощью ВЭЖХ.

Проведение анализа ВЭЖХ</